乳与乳制品病原微生物检验方法溶血性链球菌的检验.doc

乳与乳制品病原微生物检验方法溶血性链球菌的检验 YLNB4.5 1．仪器及器材 1.1 恒温培养箱：36±1℃。 1.2 恒温水浴锅：36±1℃。1.3 显微镜。1.4 离心机：4000 r/min1.5 均质器或灭菌乳钵。1.6 灭菌平皿：直径90mm。1.7 灭菌试管：10mm×100mm 、16mm×160mm1.8 灭菌吸管：1mL、5mL 、10mL。 1.9 冰箱：0～4℃1.10 灭菌锥形瓶：100mL。1.11 架盘药物天平：0g～500g,精确至0.5g。1.12 灭菌棉签、镊子等。2. 培养基和试剂2.1 葡萄糖肉浸液肉汤：按GB 4789.28中4.1规定，在肉浸液肉汤内加入1%葡萄糖。 2.2 肉浸液肉汤：按GB 4789.28中4.1规定。2.3 匹克氏肉汤：按GB 4789.28中4.62规定。2.4 血琼脂平板：按GB 4789.28中4.6规定。2.5 人血浆。2.6 0.25%氯化钙。2.7 灭菌生理盐水。2.8 杆菌肽药敏纸片(含0.04单位)。3. 检验程序　　 检 样 检 样 25g(ml)+225ml灭菌生理盐水 36±1℃血 平 板葡萄糖肉浸液肉汤 血 平 板 葡萄糖肉浸液肉汤 或匹克氏肉汤 24h 36±1℃ 24h 血平板（分纯培养） 血平板（分纯培养） 36±1℃ 24h 观 察 溶 血杆菌肽敏感试验革兰氏染色链激酶试验 观 察 溶 血 杆菌肽敏感试验 革兰氏染色 链激酶试验 报 告 报 告 4. 方法4.1 样品处理　　按无菌操作称取食品检样25g （mL），加入225mL灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液。4.2 培养　　将上述混悬液吸取5mL，接种于50mL葡萄糖肉浸液肉汤；或直接划线接种于血平板，如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36±1℃培养24h，接种血平板，置36±1℃培养24h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。4.3 形态与染色　　本菌呈球形或卵圆形，直径0.5～1μm，链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者20～30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。4.4 培养特性　　该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约0.5～0.75mm，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有2～4mm界限分明、无色透明的溶血圈。4.5 链激酶试验　　致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶)，此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。　　吸取草酸钾血浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入18～24h36±1℃培养的链球菌培养物0.5mL及0.25%氯化钙0.25mL(如氯化钙已潮解，可适当加大至0.3%～0.35%)，振荡摇匀，置于36±1℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固(凝固程度至试管倒置，内容物不流动)。然后观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴性。　　草酸钾人血浆配制：草酸钾0.01g放入灭菌小试管中，再加入5mL人血，混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾人血浆。4.6 杆菌肤敏感试验　　挑取乙型溶血性链球菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于36±1℃培养18～24h，如有抑菌带出现即为阳性，同时用已知阳性菌株作为对照。