一种新的分泌蛋白基因NSP019的克隆和表达的研究.docxVIP

一种新的分泌蛋白基因NSP019的克隆和表达的研究 第一部分 第一部分 NSP019的克隆及在真核细胞中的表达 为了对NSP019的功能和特性进行研究，验证生物信息学的预测结果，我们首先设计了一定的引物，通过PCR方法，从人垂体cDNA库中克隆到此基因的ORF。然后利用特定载体，在真核细胞中表达此基因，并对其进行了进一步的研究。 材料与方法 技术路线 生物信息学分析 土 按预测序列，设计NSP019基因0RF的PCR引物 上 从人脑垂体cDNA库中PCR扩增NSP019基因(ORF) 上 扩增产物回收———卜 32P标记扩增片段 上 上 核酸内切酶酶切 用Northern blot检测该分泌蛋白目的 片段、质粒载体 基因在组织中的分布 上 用DNA连接酶与载体连接 一种新的分泌蛋白基因NSP019的克隆和表达的研究 第一部分 ～ 一一增 ～ 一 燃 一僦 桃 撇 上一枷上一骺上一删。0㈣一上 ～～；穹 一一． 用Western blot验证分泌性 免疫荧光法进行亚细胞定位 一、实验材料 1．菌株和细胞株 克隆菌株E．coli DH5 Q，用于扩增与质粒载体连接的目的基因片段， 由国家人类基因组南方研究中心保存。 绿猴肾细胞株COS一7，用于NSP019基因的真核表达，由国家人类 基因组南方研究中心保存。 细胞用DMEM加10％的胎牛血清，置于5％cch，37C培养。 2．基因克隆的主要试剂及材料 PCR purification Kit QIAGEN公司 Gel Extraction Kit QIAGEN公司 一种新的分泌蛋白基因NSPOl9的克隆和表达的研究 Plasmid DNA Miniprep System(Mini-M) VIOGENE公司 Pfu DNA聚合酶 上海博彩生物有限公司 Taq DNA polymerase 上海申友公司 各种限制性内切酶 NEW ENGLAND BIOLAB公司 T4 DNA连接酶Promega公司 3．Western blot的主要试剂及材料 脂质体 GibcoBRL公司 TALON金属亲和纯化树脂 Clontech公司 一抗(鼠抗人C-Myc 9E10) Clontech公司 二抗(HRP-羊抗鼠IgG) Santa Cruz公司 ECL plus检测显色试剂盒 Amersharn Pharmacia公司 PVDF蛋白转移膜 Amersham Life Science公司4．Northern blot的主要试剂及材料 随机引物标记试剂盒 宝生生物工程(大连)有限公司 人类多组织RNA印迹膜 Clontech公司 同位素P32 PE公司。 5．亚细胞定位的主要试剂及材料 一抗Tag抗体(ggX c-myc 9E10) Clonteeh公司 二抗(FITC-羊抗鼠IgG) Clontech公司 6．质粒载体 pcDNA3．1／Myc-His(+)A Invitrogen公司 一种新的分泌蛋白基因NSP019的克隆和表达的研究 第一部分 该载体含有新霉素抗性基因和氨苄抗性基因，人巨细胞病毒早期启 动子，在多克隆位点后面有C-myc表位(Glu-Gln·Lys-Leu-Ile·Ser-Glu-Glu- Asp-Leu)并1]C端多组氨酸标签(6XHis)。pcDNA3．1可在大肠杆菌中扩增， 并在哺乳动物细胞中表达插入的片段(图1)。 图1 pcDNA3．1／Myc-His(+)载体图 二、主要仪器 1．PCR基因扩增仪(9700)PE公司 2．分光光度计(DU530) BECKMAN公司 3．电转化仪(CK40) BIO—RAD公司 4．蛋白电泳仪0aAC3000) BIO．RAD公司 5．ABI PRISM377DNA Sequencer PE公司 6．Olympus荧光显微镜 Olympus有限公司 一种新的分泌虽白基因NSP019的克窿和表选的研究 第一部分 三、实验方法 I．生物信息学分析 1)序列的拼接与相似性比对 采用序列分析软件BLAST；GeneDoc：GCG的软件包(Wisconsin Package Version 1 0．0，Genetics Computer Group)；Clustalx。 序列表达标签(EST)分析和电子拼接(Assemble)采用了PE公司 的AutoAssemblerTM软件，DNA Striderl．2。 引物设计分析采用了Primer Expressl．0和PrimerPremier4．0软件。 2)信号肽分析 采 用 网 上 的 共 享 web 软 件 SignalP http：／／www．cbs．dtu．dk／services／SignalP-2．0／——， 及PSORT http：／／psort．nibb．ac．ip／，使