DNA复制 (2)生物化学.pptVIP

Molecular Biologyof POB 分子生物学狭义定义为以 Central dogma为主线的生物信息流及其机制 F. Crick’s central dogma DNA Replication 半保留复制机制 复制起点和方向 Okazaki(岡崎)片段 复制的几种方式 DNA复制相关酶 大肠杆菌DNA合成全过程 半保留复制机制 (Semiconservative replication of DNA) DNA的复制遵循半保留原则进行. 亲代DNA分子每一条链各自作为模板，合成一条互补链，新合成的两条链中一条是旧链，一条为新链。 1958年Matthew Messelson 和 Franklin Stahl 用令人信服的实验证明了DNA的半保留复制机制. 半保留复制 DNA复制的起点和方向 (Replication origin direction) 大肠杆菌和其他细菌DNA的复制有一个固定的起点，称为 replication origin (ori), 复制从ori 的两个方向同时进行，形成两个复制叉(repli-cation fork) 。ori C 是大肠杆菌的复制起始点，由245个碱基组成， Okazaki 片段(Okazaki fragment)  双链DNA的两条链走向相反，而DNA的合成酶只能5’ → 3’的方向合成，这显然矛盾. 冈崎(Reiji Okazaki)利用同位素标记新生DNA分子后发现，半数同位素先参入到较短的DNA片段中. Three models for DNA replication fork What Okazaki did？ Ring structure model for the lagging strand of DNA replication DNA复制的几种模式 双向复制(Bidirectional) ?形 (大肠杆菌等细菌DNA); 线性染色体(真核细胞); 单向复制(Unidirectional) D型(病毒DNA); 滚环式(噬菌体DNA); Patterns of DNA replication 聚合酶链反应(PCR)原理 ?亚基形成一个围绕DNA的环状钳 Function of DNA ligase TopoI和TopoII松弛DNA负超螺旋 由Topo II参与的各种反应 细菌复制叉上引发体的作用 RNA引物由DNA聚合酶I的5’?3’外切酶活性除去 DNA replications in eukaryotes are still not well understood. (a) 松弛 (b) 连环与去连环 ( c) 打结与去结 DNA复制过程中形成的链状分子(catenanes) 需要拓扑酶来帮助解离 Other proteins involved in DNA replication of E. coli 1. DnaA等蛋白质结合到大肠杆菌复制起始位点oriC的特征核苷酸序列上 2. 解旋酶(Helicase)帮助将双链DNA解旋成单链DNA 3. SSB (单链DNA结合蛋白) 与单链DNA结合帮助稳定单链结构 4. Primase合成RNA片段 5. DNA 聚合酶III以RNA片段为引物开始合成DNA 6. DNA复制叉(replication fork)的形成, DNA合成向两个方向同时进行, 滞后链(lagging strand)上的Okazaki片段不断被连接成大片段 7. 拓扑异构酶 (Topoisomerases) 帮助消除复制过程中DNA螺旋产生的纠缠 8. RNA引物被DNA聚合酶I去除,补齐缺口; 9. 最终由连接酶连接成完整的染色体DNA. Initiation of DNA replication RNA primer * DNA 1957年 转录 RNA 翻译 Protein DNA 1970年 反转录 Protein RNA Replication Replication Replication Messelson Stahl’s experiment DNA replication of E. coli 电镜照片 新生链（红色） Structure of ori C E coli基因组只有一个oriC, 但人基因组有上万个复制ori Okazaki证明为这种 Pulse-labeling 实验：大肠杆菌在含同位素培养基中培养30秒（红）后分离大肠杆菌DNA，在碱性条件下超离心； Pulse-chase实验: 将大肠杆菌在含同位素的培养基中培养30秒钟