酶分子的化学修饰.pptVIP

本 章 小 结 1.什么是酶分子修饰？ 2.酶分子修饰的基本要求和条件？ 3.酶分子的修饰方法？概念及方法？ 4.酶修饰后的性质变化？ 磷酸化反应 蛋白质磷酸化是由蛋白激酶催化将ATP中的磷酸 基团转移到氨基酸残基的功能集团上。 常见的磷酸化修饰的基团： 丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的羟基 来源：Lys, Arg, His, Gln 修饰反应：酰基化与烷基化 酰基化修饰剂: 三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS） 烷基化修饰剂： 2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等 常见基团的化学修饰反应：氨基 特定的氨基酸残基侧链基团的化学修饰 巯基的化学修饰 氨基的化学修饰 羟基的化学修饰 咪唑的化学修饰 胍基的化学修饰 二硫键的化学修饰 巯基的化学修饰 5,5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB） 氨基的化学修饰 N-乙基马来酰亚胺（NEM） 氨基的化学修饰 氨基的化学修饰 氨基的化学修饰 羧基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 胍基的化学修饰 二硫键的化学修饰 二硫键的化学修饰 二硫键的化学修饰 氨基酸 侧链基团 修饰剂 Lys 氨基 三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸 Asp、Glu 羧基 水溶性碳化二亚胺 Arg 胍基 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮 Cys 巯基 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺 二硫键 巯基乙醇、DTT His 咪唑基 焦碳酸二乙酯、碘乙酸 Tyr 酚羟基 碘、四硝基甲烷 Trp 吲哚基 N-溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂 但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。 ③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。 8.5 酶的大分子修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。 非共价修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍 共价修饰 大分子修饰(共价)的过程 修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。 修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。 修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。 分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。 聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。 酶 半衰期 相对稳定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)–SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)–SOD 24 h 240 聚乙二醇-SOD 35 h 350 8.6 酶的金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+) 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往