蛋白质胶内酶解及同位素标记实验步骤.docVIP

蛋白质胶内酶解及同位素标记实验步骤? 1?样品制备： 1.1?裂解液成分的说明： A?变性剂：又称离液剂。通过改变氢键结构使蛋白质伸展，其输水结构域完全暴露。常用Urea和ThioUrea。 B?表面活性剂（又称去污剂）：在变性剂将蛋白质结构打开后，使用表面活性剂将疏水基团溶解。常用SDS（阴离子型），Triton X-100和NP-40（非离子型），CHAPS（两性离子去污剂） C?还原剂：打开半胱氨酸的-S-S-键，常用DTT，b-巯基乙醇（含自由巯基），三丁基膦TBP（不带电荷） D?蛋白酶抑制剂：Cock-tail或PMSF。 ！注：可采用2DE的裂解液提取总蛋白质，丙酮沉淀过夜后的复溶不再使用水化液，而改为与In-solution兼容的体系复溶蛋白质样品。 1.2?制备原则 A?全部溶解 B?防止降解和修饰 C?如有必要，去除核酸 D?如有必要，去除干扰物质如糖，酚，色素等（常见于植物组织） 样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性的因素，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。 ！注： 1?建议LC-MS尽可能不要做2D Clean-up处理，该Kit处理会损失大量低丰度蛋白质。 2?必须加入蛋白酶抑制剂 3?避免丙酮反复沉淀导致的样品损失 1.3?一般性配方比例： 7M Urea 2M Thiourea ? 4% CHAPS 1% DTT ? ?0.5%?蛋白酶抑制剂 以20mL?为例，称取8.48 g尿素，5.6 g硫脲，0.8 g CHAPS，0.2 g DTT，用Milli-Q H2O定容至20 mL，按每管1mL的量进行分装，并放置-20 ℃保存。 ！注：总蛋白制备后必须跑PAGE胶，初步检测制备质量，如果条带分布均匀，无Smear等现象，可以用于下一步操作。否则重新提样。 2?酶解前准备工作 首先，确保蛋白质丙酮沉淀后无以下物质干扰： 1?还原剂（例如DTT）； 2?高浓度的去污剂（例如SDS）； 3?未灭活的蛋白酶； 4?任何含有氨基的物质（NH2-）（对iTRAQ标记效率影响巨大） ！注：以丙酮沉淀蛋白质后，TEAB复溶，即可消除以上各类物质影响。 其次，做好实验准备和细节 1?戴手套 2?在开盖之前，让所有的试剂达到室温 3?每次震荡之后开盖之前都要离心使溶液收到管底 4?在整个实验过程中，记录缓冲液，盐和样品成分 5?写下你的样品制备过程 6?记下试剂批次号 7?戴手套拿取保存管 ?3 iTRAQ兼容的液体酶解和标记 3.1?实验组样品量5-100ug，在蛋白质提取时精确定量 ！注：在TEAB复溶后，最好再定量一次，以确保不出现实验误差！ 3.2?加入20uL DissolutionBuffer (其实是TEAB，浓度：)，再加入1uL Denaturant?（SDS 2%） !注：丙酮沉淀后，使用低转速离心（小于5000rpm，低于20min），可能会造成蛋白质无法完全沉淀，有一定的损失，但对于之后的完全复溶有好处，推荐！ 3.3?每管加入2uL ReducingReagent?（是TECP，类似DTT用途），漩涡震荡，短暂离心； 3.4?在60度孵育1h（打开二硫键–S-S-） 3.5?短暂离心，把液体甩到管底 3.6?每管加入1uL CysteineBlocking Reagent?（具体何物不详，类似IAA的封闭试剂） 3.7?室温孵育10min（封闭掉打开二硫键后的半胱氨酸–S残基） ！注：修饰类型不用特别关注，在搜库是选中iTRAQ，软件便会考虑还原烷基化的修饰类型。 3.8?试剂盒自带Trypsin，使用约25uLMilli-Q?水重悬。 ！注：最好使用Sigma质谱级胰酶，根据AB工程师说法，iTRAQ自带胰酶酶切效率不高 3.9?每管样品加入10uL?上述胰酶液 ！注：酶：底物比例=1：20-50，可酌情调整！ 3.10?漩涡震荡，短暂离心 ！注：最好此时用精密pH试纸测量体系PH值，应以介于7.5-8之间，胰酶酶切效率和PH值关系巨大！如果pH值不正常，要从水、样品是否纯化、试剂过期等几个方面找原因，如果体系PH值不对，不需要用HCl或NH3H2O调整，重做！ 3.11?在37度下孵育过夜（其目的是充分酶切，12-16小时即可，无严格时间要求！） ??！注：为了保证下一步最大的标记效率，酶切体系总体积应小于50uL！ 3.12?取出iTRAQ标记，室温平衡，短暂离心至管底 ??！注：iTRAQ试剂极端怕水，每管试剂中充有氮气保护，一旦开盖，需立即用完！ 3.13?加入70uL?乙醇（试剂盒自带）至每管标记中 3.14?震荡混匀，短暂离心 3.15?将每管标记分别