蛋白组学实验流程.docVIP

蛋白质组学实验技术流程 1蛋白提取 目的：尽可能多的将植物组织中蛋白质提取出来。 1.1 试剂和溶液 （1）匀浆缓冲液 本实验室蛋白质提取常用的匀浆缓冲液有两种：1）Tris-HCl 匀浆缓冲液；2）磷酸（PBS）匀浆缓冲液。 Tris-HCl匀浆缓冲液： 20 mM（m mol/L） Tris-HCl (pH 7.5)，250 mM蔗糖，10 mM EDTA，1 mM PMSF（使用前加入），1 mM DTT（使用前加入），1 % w/v 磷酸（PBS）匀浆缓冲液： 50 mM PBS(pH 7.5)，250 mM sucrose 蔗糖，1 ％(g/mL) PVPP，2 mM EDTA-Na2 ，2 ％（v/v） β-巯基乙醇（使用前加入），1 mM PMSF [ （2）蛋白抽提液：pH7.5Tris-HCl饱和酚。 （3）蛋白沉淀液：0.1M醋酸铵（配制溶液为甲醇），即200 mL 甲醇中加入1.54 g （4）蛋白沉淀洗涤液：丙酮（内含13 mM DTT），即100 mL 丙酮加入0.154 g DTT。 1.2 操作步骤 （1）准备冰块和液氮，并打开冷冻离心机（Sorvall Biofuge Stratos，Germany）低速转动（1000rpm）降温至-4℃ （2）将植物组织鲜样用液氮研磨至细粉状，再加入匀浆缓冲液和2 ％（v/v）巯基乙醇（或1 mM DTT）以及1 mM PMSF继续在冰浴下研磨成匀浆。（注意：一般以0.5 g植物鲜样加2 mL的匀浆缓冲液的量液氮研磨，另外研磨的粉状物越细越好。） （3）研磨后的匀浆液装入离心管，加入同体积的pH7.5Tris-HCl饱和酚（酚提取蛋白），放入振荡器入振荡15-30 min后，-4℃低温离心机15000rpm离心15min （4）离心取的酚相，加入3倍体积的醋酸铵，放入－20℃ （5）离心取沉淀，洗涤沉淀三次，前一次用醋酸铵洗涤，后两次用冷丙酮（－20℃ （6）离心后的蛋白沉淀用真空离心浓缩干燥仪（Christ CT 02-50，Germany）冻干。（如果不立即使用，蛋白干粉冻于－20℃ 2蛋白裂解和定量 目的：尽可能增大蛋白干粉的溶解性，并对溶解的蛋白样品进行准确定量。 （1）样品裂解液： 7 M尿素，2 M硫脲，4% w/v CHAPS，2% v/v 两性电解质（Ampholine，1.6 % v/v pH 5～8，0.4% v/v pH 3.5～10）， 1% w/v DTT（使用前加入） （2）Bradford 存储液和工作液，参见《蛋白质技术手册》（汪家政、范明）56-60页。 3 双向电泳 目的：通过双向电泳将蛋白质按等电点和分子量分离，以获得特异蛋白质。本实验室常用的电泳方法IPG固相电泳。 3.1 试剂和溶液 （1）不同pH梯度范围的IPG胶条的规格选择 pH Range 3-10 3-10nonlinear 4-7 3-6 5-8 7-10 3.9-5.1 4.7-5.9 5.5-6.7 6.3-8.3 生物体中大部分蛋白的等电点在pH4－8之间，线性宽pH范围的胶条（pH3－10）可以在同一块凝胶上显示样品中绝大多数的蛋白质，但大量的蛋白点都集中在胶条的中间，两边的蛋白点较少，从而造成中间的分辨率较低。 非线性宽pH范围的胶条（pH3-10nonlinear）将pH4－8之间的距离相对拉大，而两端pH范围的距离相对缩短，因此可以较好地分离大部分pI4－8的蛋白质。 使用窄范围重叠pH梯度的胶条可以大大提高分辨率和灵敏度。 IPG胶条的长度：7cm、11cm、17cm、18cm、24cm （2）IPG平衡液 50 mM Tris-HCl (pH6.8)，6 M尿素，30% v/v甘油，2.5% w/v （3）浓缩胶 浓缩胶贮存液：29.2% w/v丙烯酰胺，0.8% w/v甲叉双丙烯酰胺。 附100 mL浓缩胶储液配方： Acylamide 29.2g Bis(甲叉) 0.8g 超纯水定溶于100 mL 浓缩胶缓冲液：200 mM Tris-HCl (pH6.8)，0.2% w/v SDS。 附100 mL浓缩缓冲液配方： Tris 3.03g SDS 0.2g 加80 mL超纯水，用盐酸调至pH 6.8后定容至100 mL 附 浓缩胶（4％）配制： 总体积 10 mL 15 mL 18 mL 浓缩胶储液 1.5 mL 2.25 mL 2.7 mL 浓缩胶缓冲液 2.5 mL 3.75 mL 4.5 mL 超纯水 6 mL 9 mL 10.8 mL 10%APS 100μL 150μL 180μL TEMED 20μL 30μL 36μL （4）分离胶 分离胶贮存液：30% w