成熟胚高效转基因系统的建立(Ver_2011.03.21).doc

PAGE 1 成熟胚高效转基因系统的建立 水稻成熟胚愈伤组织的诱导 稻成熟种子脱壳后，挑选饱满光洁无菌斑的种子备用。 将种子放入50ml离心管中，用70%乙醇消毒1min。 倒去乙醇，加入30%(v/v)NaClO溶液(有效氯约1~1.2%)消毒30min。 倒去NaClO溶液，用无菌水清洗5遍，最后1遍在无菌水中浸泡30min。 倒去无菌水，将种子置于无菌滤纸上吸干。 将滤纸上的种子用镊子转入诱导培养基中，每皿9-10颗，28℃，光照培养3-4周。 胚性愈伤的继代增殖 将自然分裂的胚性愈伤（初始愈伤周围散落的颗粒性小愈伤）转到新鲜的诱导培养基上，28℃，光照培养10-14天即可使用。 14天后愈伤不能用完，可置于22℃，暗培养7-14天继续使用，但转化效率会下降。 农杆菌侵染 农杆菌培养：从保菌管吸取50?l原液于5ml YEP培养液（含50mg/L Kan和50mg/L Str）中，28℃，240rpm振荡培养16-20h，至OD600＝1.0-1.5。 菌悬液制备：取1ml培养完毕的农杆菌液离心（4000rpm，4℃，15min），弃上清，用30ml AAM培养液（含200μM As）重悬，稀释成OD600=0.08-0.1的菌悬液。 共培养 挑取生长健康的愈伤于带有滤纸的培养皿中（3-4皿继代的愈伤转化一个载体），再转入30ml菌悬液中，轻轻颠倒离心管约10min，使愈伤与菌液充分接触。 倒去菌悬液，将愈伤置于无菌滤纸上吸干。 将愈伤转入共培养基上，20℃-22℃，暗培养3天。 抗性愈伤选择 将愈伤转入玻璃瓶中，用无菌水清洗至少5次，加400mg/L羧苄青霉素（Car），浸泡15min，最后再用无菌水清洗1次。 将愈伤置于无菌滤纸上吸干，再转入选择培养基（含50mg/L潮霉素，300mg/L头孢拉定），28℃光培养4-5周。每两周换一次选择培养基。 抗性愈伤分化 挑取从同一愈伤来的抗性愈伤2-3颗置于分化培养基上，28℃光照培养（14h/10h光周期，光强为2000lx）。 植株再生 分化培养10-14天后愈伤组织上会有绿点冒出，当绿芽长至5cm左右，转入生根培养基中，28℃光照培养（14h/10h光周期，光强为2000lx）。 10-15天后开盖炼苗，转入水培或土培中继续培养。 水稻转基因培养基配方： NB培养基 N6大量元素+B5微量元素+B5有机元素+30 g/L 蔗糖 诱导培养基 NB培养基+2.0 mg/L 2,4-D+0.5g/L L-Gln + 2.8g/L L-Pro+0.3 g/L CA +3.0g/L phytagel ，pH=5.8 AAM感菌液 AA大量元素+B5微量元素+B5有机元素+0.5g/L CA＋3.9g/L MES+30g/L麦芽糖+200 ?mol/L AS，pH=5.5 共培养基 N6大量元素+B5微量元素+B5有机元素+2.0g/L肌醇+3.9g/L MES+0.5g/L CA +30 g/L蔗糖+200 ?mol/L AS+3.5g/L phytagel ，pH=5.5 选择培养基 NB培养基+2.0mg/L 2,4-D+0.5g/L L-Gln+0.5g/L L-Pro+ 0.3g/L CA + 3.5g/L phytagel + 300mg/L cefotaxime+50mg/L hygromycin，pH=5.8 分化培养基 NB培养基+0.5g/L L-Gln+0.5g/L L-Pro+1.0 g/L CA + 3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30g/L蔗糖+20g/L山梨醇+4.0g/L phytagel，pH=5.8 生根培养基 1/2 N6大量元素+1/2B5微量元素+1/2B5有机元素+20 g/L 蔗糖+3.5g/L phytagel ，pH=5.8 培养基的配制： 培养基母液配方： N6培养基母液（20倍）： 每升含： KNO3 56.6g CaCl2·2H2O 3.32g （相当于CaCl2 2.506g） MgSO4·7H2O 2.70g KH2PO4 8.0g (NH4)2SO4 9.26g B5微量母液（100倍）： 每升含： KI 0.0750g H3BO3 0.30g MnSO4·H2O 1.0g ZnSO4·7H2O 0.2g Na2MoO4·2H2O 0.025g CuSO4·5H2O 0.0025g CoCl2·6H2O 0.0025g B5有机母液： 烟酸 1mg/ml 盐酸吡哆醇(VB6) 1mg/ml 盐酸硫胺素(VB1) 10 mg/ml 肌醇 10 mg/ml 铁盐（100倍）： FeSO4·