遗传图的制作和基因定位演示文稿.ppt

电泳条带大小 人 人-CHO杂种细胞 阳性细胞 阴性细胞 含人4号染色体的人-CHO杂种细胞 不含人4号染色体的人-CHO杂种细胞 3.5kb √ √ √ √ 6.8kb √ √ √ 以人体白蛋白基因cDNA为探针的克隆基因定位法定位结果 原位杂交法（in situ hybridization） 是一种分子水平和染色体水平相结合、应用比较广泛而直接的基因定位方法，以标记了同位素、生物素或荧光染料的待定位基因的特定DNA序列或该基因转录产生的RNA分子为探针，直接同变性后的中期染色体进行原位杂交，该探针就会同染色体DNA与其互补的序列结合成双链，通过放射自显影或显色技术，就可确定标记了放射性同位素或非放射性同位素物质的探针在染色体上的位置，达到基因定位的目的。 荧光原位杂交技术（fluoresence in situ hybridization, FISH） 它是近年来细胞遗传学最重要的进展。其原理如下：首先将生物素、地高辛配基或其他方法修饰的核苷酸，用切口平移法或PCR技术渗入到DNA模板（靶基因）中，以用作探针，将含有人体中期染色体的标准显微制片放入RNase（RNA酶）液中1小时以除去RNA，并将染色体DNA变性，然后将变性探针加到染色体制片上，37℃ 保温过夜后，洗去过量的未结合的DNA，最后显色观察，统计荧光标记在第几号染色体及哪一区，荧光原位杂交结果显示的荧光亮点处即表示探针与染色体上的相应的结合处，即靶基因的位置。 FISH技术可直接确定空间位置紧密连锁的探针顺序，已成为一种最直接分析DNA序列在染色体或DNA分子上排列的分子细胞学技术，已被广泛地应用于基因组结构的研究和DNA分子物理图谱的构建。 FISH技术的两张图片 原位PCR （in situ PCR） 原位PCR是在单细胞或组织切片上对特异的核苷酸序列进行原位PCR扩增，再进行DNA分子原位杂交以进行细胞内基因（或特定DNA片段）的定位或检出的技术。它是原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏度相结合的一种技术，使得靶基因的检测技术有了极大的改进。 原位PCR有间接法和直接法两种：间接法是先在细胞内对DNA分子原位扩增，而后进行原位杂交；直接法是将标记的核苷（放射性同位素或荧光素标记的引物）在原位扩增之前加入PCR反应液中，在扩增过程中，标记的核苷酸直接渗入PCR产物中，然后用放射自显影、免疫组织化学或荧光检测技术进行DNA的定位与检测。 原位PCR的基本步骤 （1）固定细胞，尽量保存细胞固有的形态与结构； （2）蛋白酶消化：用胃蛋白酶、蛋白酶K等消化固定后的蛋白质交联网络屏障，使PCR反应试剂与靶DNA充分接触； （3）原位PCR扩增； （4）产物检测：直接法可用放射自显影、免疫组织化学或荧光检测等，间接法需用特异性标记探针进行引物杂交。 思考题 1、本章介绍了几种不同的基因定位方法， 这些方法有什么异同？ 2、除了本章介绍的基因定位方法外，查阅相关资料，谈谈你还知道哪些别的基因定位方法。 * 两对基因的连锁分析和作图实例 脉孢霉的烟酸依赖型nic需要在培养基上添加烟酸才能生长，腺嘌呤依赖型ade需要在培养基上添加腺嘌呤才能生长。将nic+和+ade两个菌株杂交。此前我们已经分析过，一对基因杂交会产生6种不同的子囊型，两对基因杂交会产生6X6=36种不同的子囊型，但这36种不同的子囊类型可归纳为7种基本子囊型，如下图所示： 子囊型 1 2 3 4 5 6 7 基因型次序 + ade + ade nic + nic + + + + + nic ade nic ade + + + ade nic + nic ade + ade nic ade + + nic + + ade nic + + ade nic + + + nic ade + + nic ade + + nic ade + ade nic + 分离发生时期 MIMI MIMI MIMII MIIMI MIIMII MIIMII MIIMII 子囊型类型 PD NPD T T PD NPD T 实得子囊数 808 1 90 5 90 1 5 交换类型 无交换 1-4，2-3四线双交换 1-4单交换 2-3，2-4三线双交换 2-3二线双交换 1-3，2-4四线双交换 1-3，2-3三线双交换 脉孢霉nic+ X +ade杂交结果 （1）先判断这两个基因是独立分配还是连锁的。根据表中第1种子囊型和两个亲本完全相同，其子囊数为808个，占整个后代子囊数（1000）的80.8%，即绝大部分后代为亲组合；从第1种子囊型的分离发生时期来看