蛋白质结构解析技术应用.pptVIP

是迄今研究蛋白质结构最有效的方法 优点： 不损伤样品：水溶性蛋白、膜蛋白、大分子组装体与复合体 分辨率高，：能达到的精度是其它任何方法所不能比拟的。 无污染、快捷 能得到有关晶体完整性的大量信息 蛋白质分子大小：10nm 分子中原子的距离：0.1nm=1A X-射线的波长：0.5A-1.5A 缺点： 蛋白质分离纯化技术要求高 蛋白质晶体难以培养，晶体结构测定时间较长。 很难捕捉到分子的动态信息 4. 优缺点 本节小结 晶体及衍射的基本概念 蛋白质晶体X衍射基本程序 X衍射分析蛋白质结构的优缺点 蛋白质N端测序仪器基于的化学原理是什么，简述之。代表仪器有哪些？它们有什么进步？ N-末端氨基酸的测定方法有哪些，简述之。 蛋白质Edman降解法的原理，Edman降解法的改良方法有哪些，简述之。 简述蛋白质C末端降解测序的程序 氨基酸分析仪测序操作流程。 C末端与N末端蛋白质序列仪有哪些相同和不同之处。 试比较C末端与N末端蛋白质序列的优缺点（影响因素）。 化学法一级结构测定的步骤有哪些，简述之。 基因测序法翻译蛋白质一级结构的实验方法。 如何确定二硫键和酰胺基位置，为和要确定？ X 射线衍射测定蛋白质构象的原理和基本程序。 思考题 第三节 核磁共振技术Nuclear Magnetic Resonance （NMR） 原理 适用范围及优缺点 基本概念 核磁共振结构测定基本程序 另外，蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同，在分析的时候要考虑到这个问题。核磁共振技术可以分析液态下的肽链结构，这种方法绕过了结晶、X－射线衍射成像分析等难点，直接分析自然状态下的蛋白质的结构。 现代核磁共振技术已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理。从某种意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。 1.核磁共振波谱仪原理 1．永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。 2 ．射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。60MHz或100MHz。 3 ．射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。 4．样品管：外径5mm的玻璃管,测量过程中旋转, 磁场作用均匀。 与UV-vis和红外光谱法类似，NMR也属于吸收光谱（是处于强磁场中原子核对射频辐射的吸收 核磁共振波谱仪 2. 适用范围及优缺点 近生理状态溶液中的蛋白质构象测定 蛋白质分子动力学（在s到ps时间尺度上） 小分子和蛋白质作用的动力学过程 蛋白质可变形尾巴部分的构象 观察蛋白质结构的运动过程（主侧链运动、不同温度和压力下蛋白质的折叠和去折叠过程） 结构定性和定量分析 非损伤性测定法，对样品无破坏作用，但不能太大，溶解性要好，稳定性要高，不降解不聚合 ，可进行同位素标记等。 缺点： 灵敏度低 适用分子量较小的蛋白质 3. 基本概念 参数/概念 含义 结构信息 峰位 基团的化学势移δ 二级结构信息，反映微环境变化 峰形 耦合常数及基团间的耦合关系 主链和侧链构象变化 峰面积/峰强度 核的相对数量以及弛豫 弛豫过程 从激化的状态回复到平衡状态的过程 弛豫时间 弛豫过程所需要的时间 NOE信号强度 质子对间的距离， 越大反映残基间短程 二维同核核磁共振 100以下氨基酸残基数， 稳定的溶于水的自然风度的蛋白质样品 三维/四维异核核磁共振 大于100以上氨基酸残基数 检测1H、 13C 、15N核之间的相关 共振信号。 液体核磁共振 13C直接检测、长程NOE信息收集 膜蛋白／去污剂胶束复合物(应用去污剂胶束来模拟膜蛋白的磷脂双分子层环境) 固体核磁共振 只能关注较小分子的结构 膜蛋白／磷脂复合 谱仪频率 30MHz→900MH →1000MHz 仪器工作方式 连续波谱仪→ 脉冲-傅里叶变换谱仪 4. NMR结构测定基本程序 纯度：不应有铁及其它杂质、粘度要低、 浓度： 5-10%； 5mg (1H), 15-30 mg(13C)； 傅立叶变换-NMR需1 mg 溶剂：1H谱= 四氯化碳(1H), 、二硫化碳 氘代溶剂：氯仿、丙酮、苯、二甲基亚砜的氘代物 标样浓度（四甲基硅烷 TMS） ： 1% 样 品→1D-2D-3D（一级和二级结构)→计算出三维结构→能量最小化优化→ 高分辨率三维结构几何 NMR详细步骤 1.样品制备：将蛋白质溶于D20或H20中，相对分子质量大于6000的需要事先用15N或15N、13C加以标记 2.一维NMR实验：测定1HNMR谱图。用D2O交换以及做