细胞生物学第三章 细胞生物学研究方法.pptVIP

* Low speed High speed 差速离心 Differential centrifugation (2)密度梯度离心 （Density gradient centrifugation） 利用介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞组分分层、分离。 类型：速度沉降、等密度沉降。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 分离活细胞的介质要求： 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）pH值中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。 * Rough ER Golgi vesicles 如何从培养的细胞中分离细胞核和核糖体？ 二、蛋白质的层析分离 * 利用各带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。 1.离子交换层析(Ion-exchange chromatography) 2.凝胶层析(Gel filtration chromatography) * 按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称为凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。 3.亲和层析(Affinity Chromatography) * The apply of antibodies in protein purification 三、蛋白质的电泳分离 * Protein Separation Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Electrophoresis - separate molecules by charge: mass ratio under influence of electric field. SDS equalizes charge, thus SDSseparates by size. 1.SDS* * 哪一个条带是我们需要的蛋白条带？ 它的表达量有什么变化? 2.免疫印迹 (Western Blot) 3.二维凝胶电泳(Two dimensional gel electrophoresis) * 可在同一块聚丙酰胺凝胶上辨认出2000多种蛋白质的存在。 二维电泳将等电聚焦和SDS电泳整合到一起,利用了蛋白质的电荷特性和分子大小特性。 分辨率得到极大提高。 四、RNA的分离与分析 * 每一种细胞的基因表达谱是不同的。 “一个基因编码多个蛋白质”的概念出现，RNA水平的研究的重要性显得更为突出。 利用RNA分子量小、可溶于水，并能在乙醇中沉淀等生化特点，可分离RNA总RNA。利用mRNA的3’端有一段poly A的结构特性，将总RNA通过一个填充物上带有poly T的柱子，便可特异性地从总RNA中把mRNA分离出来。 可采用PCR或Northern杂交方法研究某一已知基因在某种类型或状态细胞中的表达情况；利用mRNA的消减杂交及基因芯片等研究某两种或多种类型或不同状态细胞中基因活动差异，进一步分离所对应基因。 PCR * 五、DNA的分离与分析 * 利用DNA溶于水和能被乙醇沉淀的特性，常使用蛋白酶和SDS,以及RNA酶来分离DNA。 通过RNA的分析，发现某个基因表达水平的改变有意义，就可将其mRNA反转录为cDNA，并测定其核苷酸序列，进一步合成带有标记的DNA探针，并将其与基因组DNA文库杂交，可得到含有目的基因的基因组DNA片断的克隆，用于其结构和功能分析。 比较小的基因，可用PCR法直接从基因组DNA扩增获得。也可采用分段扩增，然后再将扩增片断重组在一起。 * Southern Blot - + * Autoradiography 放射自显影(术) 细胞外输性蛋白的合成与分泌过程 第四节 活细胞内分子的分析 一、细胞内分子的示踪 * Autoradiography George Palade Pancreqtic cells（胰腺细胞)- Specialized for secretion Pulse Chase protein radiolabelling 35S-amino acids 二、细胞内离子浓度的测定 * (一)局部离子浓度测定 1.采用常规pH计的基本原理 2.膜片钳记录(patch clamp recording) 细胞内离子浓度的测定需要有精密的设备和专门的技术,还需要极其灵敏的离