L_乳酸高产菌株的选育.docVIP

21 No. 1. 2004 食品技术 L(+-乳酸高产菌株的选育 徐子钧1 李剑1 马建芳2 王淑芳2 刘如林1 (1.南开大学生命科学学院 天津?300071;　　2.天津南开戈德集团 天津?300071 摘要:以代谢调控发酵理论为依据,利用紫外线、亚硝基胍、DES 等理化因子对乳酸菌进行复合诱变,再用高浓乳酸钙平板、纯乳酸平板、琥珀酸平板筛选得到一株高产L(+-乳酸的正向突变株M 7,平均发酵产量为90g/L ,比原菌株产量提高30%,对糖的转化率为88.9%。 关键词:乳酸菌;L-乳酸;菌种选育 中图分类号:TS201.3 文献标识码:A 文章编号:1005-9989(200401-0021-03 Breeding of L (+-Lactic acid bacteria XU Zi-jun 1 LI Jian 1 MA Jian-fang 2 WANG Shu-fang 2 LIU Ru-lin 1 (1. Life College, Nankai University, Tianjin, 300071; 2. Tianjin Nankai Guard Co.,Ltd, Tianjin, 300071 Abstract: Multiple mutagenesis(U.V., NTG, DES were applied and the L(+-lactic acid producing mutant was selected based on the pathway analysis and metabolic engineering theory. After fermentation for 72 hours, the mutant strain gave a L(+-lactic acid output of 90g/L, 30% higher than the parent strain and sucrose conversion of 88.9%. Key words: lactic acid bacteria; L(+-lactic acid; breeding 0 前言 乳酸是一种重要的有机酸,可分为D 型和L 型乳酸,人体只能代谢其中的L 型乳酸,而且L-乳酸及其盐类和衍生物在医疗、农业等许多部门都有广泛的用途[1] 。尤其近几年来,人们利用L-乳酸聚合生成的聚L-乳酸制造生物降解塑料,用以解决日益严重的环境污染问题,具有重大意义[4-6]。 然而,从自然界筛选的野生型菌株往往产量不高,达不到生产要求,产量的提高是由多基因作用的结果[7]。乳酸高产菌应具有以下生化特征:较高的乳酸脱氢酶活性,弱化的丙酮酸脱氢酶系;能耐高浓度的乳酸盐;不具有以乳酸为唯一碳源而生长的能力。本文的育种思路:高浓度乳酸钙平板上挑取菌落,筛选出耐高酸的菌株;利用琥珀酸平板筛选出EMP 途径强化TCA 途径减弱的菌株;在以乳 收稿日期:2003-10-08 作者简介:徐子钧(1977-, 硕士研究生,研究方向为资源细菌及工程。 酸盐为唯一碳源的平板上不长的菌落即筛选出不分解利用乳酸的菌株。最后获得正向突变株。 1 材料与方法 1.1 菌种 从自然界筛选到的Lactobacillus sp. S 3,已证实其产物为光学纯度95%以上的L(+-乳酸,发酵产率为68g/L 。 1.2 培养基 MRS 培养基[7];　 高乳酸钙平板:MRS 培养基加入一定浓度的乳酸钙; 乳酸平板:用1%的乳酸代替MRS 培养基中的葡萄糖成分; 琥珀酸平板:用3%琥珀酸代替MRS 培养基中的葡萄糖,其他成分不变。 1.3 复合诱变方法 1.3.1 紫外线处理 培养乳酸菌至对数生长期,制备菌悬液;将菌液进行紫外处理,照射时间为致死 22 食品技术 No. 1. 2004 率70%~80%的时间,加入到新鲜种子培养液中,避光条件下培养24 h 。 1.3.2 亚硝基胍(NTG处理 加入亚硝基胍,使其终浓度为100ìg/mL ,37℃振荡反应30 min 和60 min 后,用冷的生理盐水大量稀释。 1.3.3 硫酸二乙酯(DES诱变 离心培养至对数期的菌液,用pH7.0的缓冲液洗涤菌体2次,并稀释成浓度为108cfu/mL 菌悬液。取32mL pH7.0的缓冲液、8mL 菌悬液、0.4mLDES 充分混合(DES 浓度为1%V/V,30℃恒温振荡处理致死率为70%~80%的时间后,加入0.5mL 25%Na 2S 2O 3溶液/mL 菌液中止反应。 1.4 高产菌株的筛选 1.4.1 初筛 将经过复合诱变的菌液涂布于含有高浓度乳酸钙的平板上,筛选生长的菌株。然后对筛选到的菌株,在琥珀酸平板上和乳酸平板上进一步筛选。筛选在琥珀酸平板上比出发菌株延迟出