斑马鱼精子冻存技术专题.pdf

国家斑马鱼资源中心 第五期全国斑马鱼技术培训 （斑马鱼精子冻存技术专题） 会议手册 2017 年3 月 编辑人：潘鲁湲 编写人：（以姓氏排序）柳力月、谢训卫、胥贤 审定人：孙永华 版权声明：此手册为国家斑马鱼资源中心 （简称CZRC ）编写，服务于CZRC 主 办的各类斑马鱼技术培训会议和技术咨询服务。本手册引用图片均已标明出处， 未标明出处的图片为CZRC 原创。此手册的版权和最终解释权归CZRC 所有。 致谢 CZRC 是由国家科技部和中国科学院共同支持建设的非营利性科研服务性机构， 由中国科学院水生生物研究所代为管理。CZRC 是中国科学院模式和特色动物实 验平台的核心成员，其主要支持课题有国家重大科学研究计划课题 （2012CB944504 ）、中国科学院重点部署项目（KSZD-EW-Z-001 ）和湖北省科技 支撑计划项目等。 目录 第一章 鱼类精子超低温保存原理 1 第一节 鱼类精子超低温保藏技术概况 1 第二节 冷冻保藏剂介绍 2 第三节 冷冻过程及复苏 5 第二章 斑马鱼精子冻存和体外复苏方法 9 第一节 斑马鱼精子冻存和复苏操作要点 9 第二节 斑马鱼精子冻存操作的实验细节 10 第三节 斑马鱼冻存精子样品的体外受精 13 工作附表1 精子冻存记录表 15 工作附表2 体外受精记录表 16 第三章 斑马鱼的养殖 17 第一节 斑马鱼的养殖环境 17 第二节 循环养殖设备介绍 19 第三节 斑马鱼的繁殖 23 第四节 幼鱼的养殖 24 第五节 成鱼的养殖及安乐死 27 第六节 斑马鱼活饵的培养 28 第四章 斑马鱼常见鱼病及健康维护 33 第一节 细菌性疾病 33 第二节 寄生虫疾病 36 第三节 非感染性和先天性疾病 37 第四节 斑马鱼日常健康维护 39 地址：武汉市武昌区东湖南路7 号 电话：027 邮箱：zebrafish@ 网址： 第一章 鱼类精子超低温保存原理 第一节 鱼类精子超低温保藏技术概况 一、鱼类精子冷冻保存的历史 鱼类精子冷冻保藏技术始于20 世纪50 年代初期。1953 年英国学者Blaxter 使用干 冰保存6 月龄的大西洋鲱精巢，将精液解冻后进行授精，获得80% 的受精率，这是首例 成功的鱼类精液冻存实验。之后鱼类精液冷冻保存研究在多种鱼类上开展，早期研究主 要集中在海水鱼类，后来逐渐扩展到鲤科、鲟科鱼类中。国内最早的鱼类精子冻存研究， 是1984 年王祖昆等用液氮冻存保藏草、鲢、鳙、鲮等鲤科鱼类，取得较理想的复苏受精 率[1] 。 斑马鱼精液的冷冻保存研究始于1982 年，Harvey 等以甲醇作为抗冻剂，冷冻保存 斑马鱼精液，获得平均51%的受精率[2] 。现在应用较广的是方法是Moens 实验室在Harvey 技术的基础上改进而成的Moens-Draper protocol。该方法的优势是所需的试剂和器材简单， 易于操作且适于大批量冻存[3, 4] 。本次培训所使用的就是基于此操作规范的冻存方法。 二、低温保存技术的作用 1、可以将优质品系或濒临灭绝的品系长期保存起来，避免因长期养殖、近亲交配 而造成的种质退化和遗传变异等现象。 2、节省养殖空间，以及与之相应的人力物力资源。 3、通过配子的冷冻保存，可以为鱼类遗传育种和生物技术研究不间断地提供材料， 大大方便了遗传发育研究。 三、冷冻低温保存的原理 超低温保存 （cryopreservation ），指将生物、生命组织、或细胞等有机物质（生物材 料的含水量一般在60-90% ）和其他物质在摄氏-196 度或以下的低温保存的一种技术。在 -196⁰C 时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻 1 地址：武汉市武昌区东湖南路7 号