液相色谱的方法开发(一)分离方法-Waters LC School 培训教材.docVIP

液相色谱的方法开发 一分离方法 第一步干什么? ?想办法得到各种信息 ?向同行了解是否做过此类样品或有否类似 样品的分析方法 ?查文献如CA(化学文摘 ?仪器制造商的文献如Waters ?对色谱柱有足够的了解 ?掌握分离机理自己开发方法 ?充分了解您自己的样品 分析时要了解哪方面的情况 ?灵敏度的要求有多高? ?样品的本底是否很复杂? ?有多少组份要分析? ?对分析的精确度准确度等有多高要求? ?是否因是日常检验而要求方法容易使用? 分离时要了解哪方面的情况 ?要分离即制备的样品量有多大? ?要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? ?是否需要保持生物活性? ?对分离产物纯度的要求有多高? ?纯度或活性的鉴定如何完成? 一般的具体步骤?先用一根短的色谱柱?用相对较高的流速?使用尽可能纯度高的标准品?先用高强度的洗脱液?调节k’ 值改变保留值?调节α值改变选择性?调节柱长度改变柱效及分离速度请记住 每次改变一个参数 使用文献方法 ?色谱柱填料的种类品牌是否相同? ?注意文献方法的流动相 ?是否损害色谱柱? ?如色谱填料品牌不同需要调整流动相?注意色谱柱的规格内径柱长 ?需要调整流速进样量 ?注意梯度条件 ?了解系统的滞后体积梯度 色谱方法转换 ? 如果没有与文献或要求相近的色谱柱 ?转换进样量 ?转换流速 长度 内径 进样量初始初始现在 现在初始==×=L D L D L D Load Load 2 2 (((内径 流速初始现在初始=×=D D D F F 2 2 ( (( 反相色谱的方法开发 ?开发过程实例 ?色谱条件 ?色谱柱C184mm30mm ?流动相乙腈/水不同的溶剂强度60/40 50/5040/60由强渐弱 ?流速2ml/min ?样品 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben 改变容量因子 K 60/40 50/50 40/60 谱图 改变选择性α ?通过改变流动相改变选择性?同样强度的不同溶剂 ? 改变色谱柱 62 : 38 / 42 : 58 / 72 : 28 / 2 3 2 2 O H CN CH O H MeOH O H THF 离子型化合物的分离方式 ?使用离子交换柱离子交换法 ?主要用于强阴阳离子 ?使用反相柱 ?离子抑制色谱法 ?通过改变流动相的pH值使样品成中性?离子对色谱法 ?加入对离子使样品呈中性 离子抑制色谱 ?离子型化合物在反相色谱柱上不保留 ?改变流动相的pH值抑制样品离子的电离 ?适用于弱酸性化合物的分离 ?降低流动相的pH值使样品降低离子化 ?使用硅胶基质C18填料 ?使用条件应在填料基质的范围内 ?硅胶柱的pH在2-8较保险值3-7内 常用缓冲液及其pH值 名称pKa Phosphoric Acid 磷酸 2.12 (pKa1 Formic Acid 甲酸 3.75 Succinic Acid 琥珀酸 4.19 (pKa1 Acetic Acid 乙酸 4.75 Succinic Acid 琥珀酸 5.57 (pKa2 Phosphoric Acid 磷酸 7.21 (pKa2 Boric Acid 硼酸 9.24 Phosphoric Acid 磷酸12.32 (pKa3 离子抑制色谱实例 ?在乙腈/水及pH=7时多数保留时间很短无法完全分离CHO OH OCH 3 COONa CHO COOH OCH 3 1234 离子抑制色谱的使用范围 如果 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 ?可以有以下的选择 ?离子交换色谱 ?使用聚合物反相柱在pH高于7时用离子抑制法 ?使用离子对色谱法 在高pH值下用离子抑制 色谱柱D18-613(聚合物基质室温 流动相乙腈/0.01M NH4OH + 0.01M TBA 流速 1.0ml/min 检测UV-240nm 样品巴比妥的衍生物 巴比妥 己琐巴比妥 甲基苯巴比妥 速可巴比妥 离子对色谱法 ?在反相色谱流动相内加入离子对试剂?与样品中可电离的组份形成对离子 ?在反相色谱柱上分离离子型化合物 ?离子对试剂的类型 ?PIC A磷酸季丁铵适用于弱酸 ?PIC B烷基磺酸盐适用于弱碱 ?烷基长度不同形成对离子的能力不同 ?通常有B5B6B7B8 ?PIC D4磷酸二丁胺适用于弱碱 离子对色谱机理 用离子对还是离子抑制中性物质PIC A 酸性物质 PIC B 碱性物质R SO 3H R C OH O R O S OH O O R O P OH O O R NH 2R 2N H R 3N (R 4N