实验十二 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力.pptVIP

氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力 一、实验目的 掌握氮蓝四唑（NBT）法测定SOD活性的方法 二、实验原理 三、材料、仪器设备及试剂 1.材料：小麦叶片或其他 2.仪器设备 高速冷冻离心机；分光光度计；微量进样器；光照培养箱；容量瓶；玻棒；移液管等； 3.试剂　 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8） 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定至100ml； 750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存； 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml； 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。 四、操作步骤 酶液提取： 取植物叶片0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成匀浆，加缓冲液定容至10ml。于4℃下，8000rpm下离心10min，上清液即为SOD粗提液。 四、操作步骤 2. 显色反应：取3支试管，如下加样（体积：mL）并处理。 1 2 3 测定用样品 光对照 暗对照 0.05mol/L 磷酸缓冲液 2.8 3 3 130mmol/L Met溶液 0.5 0.5 0.5 250μmol/L NBT溶液 0.5 0.5 0.5 100μmol/L EDTA－Na2 0.5 0.5 0.5 20μmol/L 核黄素 0.5 0.5 0.5 提取液（酶液） 0.2 0 0 照光 照光 避光 四、操作步骤 3.SOD活性测定与计算： 至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。 五、结果计算 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示 SOD比活力单位以酶单位／mg蛋白表示 Ack照光对照管的吸光度；AE样品管的吸光度 V样品液总体积（ml）；Vt测定时样品用量（ml） W样鲜重（g）；蛋白质含量单位:mg蛋白／g鲜重 六、注意问题 蛋白操作的所有问题 甲腙颜色形成较快，过量形成后极易聚集形成沉淀，要密切注意反应时间 * 本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑 在光下的还原作用来确定酶活性大小 光 e 还原O2 核黄素 O2 . SOD 2H+ H2O2 + O2 还原NBT 2 甲腙 甲腙呈蓝色，560nm处有最大光吸收 O2 . + 2H+ SOD O2 + H2O2 CAT H2O + O2 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个 酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。 实验为何设置光暗两个对照？ * * *