细胞克隆形成实验.pdfVIP

细胞克隆形成实验 当单个细胞在体外增殖 6 代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。 每个克隆含有 50 以上的细胞，大小在 0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的 独立生存能力。 各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。 通过一定 的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数， 但贴壁后的细胞不一定每个都 能增殖和形成克隆。 而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。 克隆形成 率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。 由于细胞生物学性状不同， 细 胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱， 传代细胞系强； 二倍体细胞克隆形成率弱， 转 化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干 细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板克隆形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用 0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞， 并把细胞悬浮在 10%胎牛血清的 DMEM 培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿 50 、100、200 个细胞的梯 度密度分别接种含 10mL 37℃预温培养液的皿中， 并轻轻转动，使细胞分散均匀。 置 37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养 2～3 周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS小心浸洗 2 次。加 4%多聚甲醛固定细胞 5mL 固定 15 分钟。然后去固定液， 加适量 GIMSA应用染色液染 10～30 分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干 燥。 4 、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微 镜（低倍镜）计数大于 10 个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率 = （克隆数/ 接种细胞数） ×100% 平板克隆形成试验方法简单， 适用于贴壁生长的细胞。 适宜底物为玻璃的、 塑料 瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。 细胞一定要分散得好， 不 正德 利用 厚生 惟和 能有细胞团，接种密度不能过大。 平板克隆形成试验方法简单， 适用于贴壁生长的细胞。 适宜底物为玻璃的、 塑料 瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。 细胞一定要分散得好， 不 能有细胞团，接种密度不能过大。 软琼脂培养克隆形成试验基本步骤： (1)取对数生长期细胞，用 0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作 活细胞计数，用含 20%胎牛血清的 DMEM 培养液调整细胞密度至 1×106细胞 /L 。 然后根据实验要求作梯度倍数稀释。 (2)用蒸馏水分别制备出 1.2%和 0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后， 维持在 40℃中不会凝固。 (3)按 1:1 比例使 1.2%的琼脂糖和 2 ×DMEM培养基 (含有 2 ×抗生素和 20%的小牛血 清 )混合后，取 3mL 混合液注入直径 6cm 平皿中 (10cm 平皿加 7～10mL)，冷却凝 固，可作底层琼脂置 CO2温箱