第五章分子生物学研究方法 20220313230.ppt

2· 最佳连接反应 ? 经限制性内切酶切割后的线性载体分子 的自身不允许再环化。采用碱性磷酸酯 酶处理由内切酶消化产生的线性载体分 子，除去该 DNA 的 5 -P 末端，而留下一 个 5 -OH 基团。当插入了外源 DNA 片段， 其 5 为 -P 末端，从而能有效重组。 ? 在连接反应中，使用正确的载体 DNA 和外源 DNA 的比例，是获得高产重组转化子的重要 因素。 ? 用 λ 噬菌体或柯斯质粒作载体时，配制高比值 的载体 DNA/ 供体 DNA 的连接反应体系有利于 重组分子的形成。 ? 用质粒作为克隆载体，其重组体分子由一个 载体分子和一个供体 DNA 片段连接环化而成， 当载体 DNA 与供体 DNA 的比值为 1 时，有利 于这类重组体分子的形成。 3· 重组体分子导人受体细胞的途径 ? 将外源重组体分子导人受体细胞的主要途径 包括转化 ( 或转染 ) 、转导、显微注射和电穿 孔等。转化和转导主要适用于细菌一类原核 细胞和酵母等低等真核细胞，而显微注射和 电穿孔则主要应用于高等动物的真核细胞。 在基因工程中有详细介绍。 5· 4· 3 cDNA 基因克隆 ? 真核生物基因组 DNA 大，含有大量的重复序 列和内含子，难以直接分离到目的基因。通 过 RT-PCR 可以部分解决。 ? 高等生物一般具有 3 ～ 5 万种左右不同的基因， 在一定时间阶段的单个细胞或组织中，仅有 15% 左右的基因得以表达，产生出约 5000 ～ 10000 种不同的 mRNA 分子。 总 RNA 的提取 ? rRNA80%~85% ， tRNA15%~20% ， mRNA1%~5% 。 ? 异硫氰酸胍－苯酚 Trizol box. 破坏细胞机构， 释放 RNA ，核糖体蛋白与 RNA 分离，保证 RNA 完整。氯仿沉淀蛋白。异丙醇沉淀 RNA 。乙醇洗涤 RNA 。 OD 260 为 1 时， 40 μ g/mL. OD 260 / OD 280 =1.8~2.0 表示总 RNA 程 度好，低于 1.8 则有蛋白和酚污染。电泳看 18S 和 28S. ? cDNA 克隆的基本过程是通过一系列 酶催作用，使总 poly(A)mRNA 转变 成双链 cDNA 群体并插入到适当的载 体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株 细胞，构成包含所有基因编码序列 的 cDNA 基因文库。 1· 高质量 mRNA 的制备 ? 可应用 Promega PolyAT tract mRNA 分离系统分离 poly(A)mRNA 。将用生物 素标识的寡聚 (dT) 引物与 细胞总 RNA 共温育，加入 与微磁球相连的抗生物素 蛋白，用磁场吸附通过寡 聚 (dT) 引物与抗生物素蛋 白及强力微磁球相连的 mRNA 。 2· 反转录生成 cDNA ? mRNA5—————————— AAAA ? 互补 21 -CCC ———————— TTTT- 20 ? 21 -GGG ? 所有包含 Poly(A) 尾巴的 mRNA 被反转录生成 cDNA 。 ? 以 21 和 20 为引物做 PCR ： ? 21 －－－－－－－－－－ AAAA- 20 互补 ? 互补 21 ————————————— 20 3 、重组体分子的构建及转化寄主菌株 ? 双链 cDNA 群体插入载体： ? 21 －－－－－－－－－－ AAAA- 20 互补 ? 互补 21 ————————————— 20 ? 设计 21 时，让其有酶 1 的切点， 20 有酶 2 的切 点，在质粒载体上有相应的切点，就可以定 相将所有 PCR 片段插入载体。 ? 转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构 成包含所有基因编码序列的 cDNA 基因文库。 ? 载体分子有抗药性基因，在培养 基中加入相应的抗生素进行筛选。 ? 经过特殊处理的具有吸收外源 DNA 能力的细菌细胞为感受态细胞。 ? 当重组质粒分子与感受态细胞混合， 感受态细胞数量 》重组质粒分子时， 在培养基上长出的单菌落是由一个 重组质粒分子导入一个细菌细胞后 经过繁殖而形成的。 ? 在组织和培养的细胞中，一个细 胞中有些 mRNA 可拥有数千个拷 贝，而有些 mRNA 只有几个拷贝。 根据 mRNA 分子含量的多寡，可 以将 mRNA 划分为高丰度、中丰 度和低丰度 3 种不同的类型。 ? 从表中看出低丰度 mRNA ，其总量 约占总 mRNA 的 30% ，约有 11000 个左右的不同种类的 mRNA 。如果 获得 11000 个克隆，得到每一种低丰 度 mRNA 的可能只有 30 ％，因此， 为了获得一个能够代表全部低丰度 mRNA 序列的 cDNA 基因文库，必 须的最低克隆数 ( 理论值 ) 应是 11000/0·30≈37000 。 ? 由于在实验中