荧光定量PCR原理扩增曲线专题培训课件.pptVIP

Sample copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD 标准品 5 × 10 3 28.18 28.64 28.41 0.16 标准品 5 × 10 4 25.25 25.14 25.19 0.04 标准品 5 × 10 5 22.11 22.46 22.28 0.12 标准品 5 × 10 6 18.63 18.92 18.77 0.10 未知样品 ? 20.56 20.45 20.5 0.05 空白对照 None None 实验数据 绝对定量实验例 —— 乙肝病人血液中 HBV 的绝对定量 扩增效率（ E ）计算 E=10 -1/ 斜率 － 1 =10 -1/-3.17 － 1 =2.03 － 1 ＝ 1.03 标准曲线制作： 利用 Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.17x + 37.52 R 2 = 0.9988 15 20 25 30 5×103 5×104 5×105 5×106 Copies C t 绝对定量实验例 —— 乙肝病人血液中 HBV 的绝对定量 相关系数（ R 2 ）：大于 0.98 ，越接近 1 ，结果可信度越高。 扩增效率（ E ）： 0.8-1.2, 越接近 1 ，越理想。 未知样品拷贝数的计算 将 Ct 值带入线性方程： 20.5= -3.1726 X + 37.52 Quantity Unknown =10 5.36 =229087 copies 绝对定量实验例 —— 乙肝病人血液中 HBV 的绝对定量 X= 20.5-37.52 -3.1726 =5.36 相对定量解析方法 理论上目的基因表达量分析条件 Sample B Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA 提取效率相同 细胞起始数相同 实际目的基因表达量分析 相对定量的必要性 以上条件不可能同时得到满足，必须用 内对照基因 （管家基因） 进行校正，进 行相对表达量分析。 管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因 , 如： GAPDH 、 Actin 、 18S rRNA 等 筛选方法 根据文献提供 通过具体实验筛选 相对定量分析 —— 管家基因筛选 0 1 2 3 4 5 6 Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 实验组 实 验 值 β -Actin GAPDH β -2-microglobulin HPRT P P P O ? 双标准曲线法 ? 2 - △△ Ct 法 相对定量分析 —— 两种常用的分析方法 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家 基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对 表达量。 相对值 = 校正值 = 目的基因定量结果 管家基因定量结果 待测样品的校正值 对照样品的校正值 相对定量分析 —— 双标准曲线法 公式： 优点：分析简单，实验优化相对简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 相对定量分析 —— 双标准曲线法 检测样品 管家基因 H 目的基因 X 定量结果 定量结果 校正值 相对量 对照样品 6391.5 343.4 0.053 7 1.000 待测样品 1 8589.7 17.3 0.002 0 0.037 待测样品 2 7432.9 1946.1 0.261 8 4.874 实验数据 ? 荧光定量 PCR 原理 -- 扩增曲线 内容概要 ? 荧光定量 PCR 的原理 ? 荧光定量 PCR 的标记方法 ?