精选幻灯片PCR原理及检测方法解读.pptVIP

新型甲型 H1N1 流感检 测 32 核酸提取 使用试剂： 核酸提取试剂盒 QIAGEN RNeasy mini kit （ 74104 ）； 预冷的 70% 乙醇溶液（无 RNase 水配制） （自备）； β - 巯基乙醇（自备） 基本步骤： 裂解组织，释放核酸； 除去蛋白杂质； 最后获得核酸产物 33 注意事项： 1 提取核酸过程中使用的所有溶液和耗材必须 经过特殊处理，确保无 RNase 2 操作过程中必须尽量保持低温，迅速 3 操作要在生物安全柜中进行，检测标本 样品和试剂必须在生物安全柜中才可以打开 操作中必须做好防护，防止降解，污染和感染 4 提取好的核酸若不立即进行检测，应于 -20 ℃ 保存 34 RT-PCR 检测 1 ）反应体系配制 （ 25ul 体系） （在专门的生物安全柜中进行）： 使用试剂盒 ： QIAGEN one step RT-PCR kit （ 210212 ） RNase free water 11.9ul 5 × RT-PCR 缓冲液 5ul 10mM dNTP 1ul Enzymix 1ul RNasin 0.1ul 上游引物 (20uM) 0.5ul 下游引物 (20uM) 0.5ul 合计 20ul 35 对每一个建立的反应确定反应数（ n= 拟进行的 PCR 管 数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照， 阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。 具体如下： （ 1 ）如果包括对照，样品的数量（ n ）为 1 到 14 ，那么 N=n+1 ； （ 2 ）如果包括对照，样品的数量（ n ）大于 15 ，那么 N=n+2 。 2 ）将上述反应液混匀，分装到 0.2mL PCR 小管中，每 管 20μL ，分别做好标记。 3 ）加 RNA 模板（在核酸提取区） 将上述分装好的 PCR 小管分别加入模板。 首先加入阴 性对照管 （ 5μL 无菌水）， 然后分别加标本 RNA （每 管 5μL ）， 最后 加入 阳性对照 RNA （每管 5μL ）。 36 反应条件： 1 、 60 ℃ 1 分钟 2 、 42 ℃ 10 分钟 3 、 50 ℃ 30 分钟 4 、 95 ℃ 15 分钟 5 、 94 ℃ 30 秒 6 、 50 ℃ 30 秒 7 、 72 ℃ 1 分钟 回到第 5 步 40 个循环 8 、 72 ℃ 10 分钟 9 、 end 37 电泳并观察结果 ： 提前用 1 ×的 TBE 缓冲液配制 1.5-2%Agrorose gel ， 胶块凝固后将其放置在加有 1 × TBE 缓冲液的电泳 槽中，电泳缓冲液必须淹没胶块。电泳液最好新 鲜配制。 PCR 结束后，各取 5ul PCR 产物和 1ul 6 × Lodding Buffer 混匀，点样，同时加 DL2000 Marker 5ul ， 阴、阳性对照； 电泳电压： 120V 时间：胶块的体积和浓度都对电泳时间有影响，一 般 30min-1h 。根据 Lodding Buffer 中的溴芬兰指 示剂的位置来判断电泳的程度，一般蓝色指示条 带泳动到胶块 2/3 位置处，就可以观察结果了 38 NIC 引物 引物名称 目的片段 大小 备注 FluA FluA-M-F30 235bp 甲型流感病毒 M 基因通 用检测引物 FluA-M-R264 H1HA H1 F1147 527bp H1N1 亚型 检 测 通 用 引 物 H1 R1673 HuH1HA H1HA F768 327bp 人 季 节 性 流 感 病 毒 H1N1 亚型检测引物 H1HA R1094 SWH1HA-1 SW-H1 F786 153bp 此次甲 型 H1N1 亚 型 流 感病毒引物 SW-H1 R920 RnaseP RnaseP F 约 80bp 与 real-time PCR 中 RnaseP 引物一致 RnaseP R 39 一、 PCR 的定义： PCR （ polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外 DNA 扩增 技术。 近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA 片段的技术。 2 PCR 技术： 1985 年由美国 Cetus 公司的 Kary Mullis 首创，可以将微量目的 DNA 片段扩增一百 万倍以上。 优点： 敏感度高、特异性强、产率高、重复性 好以及快速简便 等，广泛应用于微生物学、考古学、 法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室， 大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地 对目的基因进行分析、鉴定。 Kary Mullis 本人因此获 1993 年诺贝尔化学奖。 3 二、 P