染色质免疫沉淀讲解.pptVIP

染色质免疫沉淀 Chromatin immunoprecipitation 基因型决定表型 破坏了基因型也就改变了表型 但是，也有一些无法解释的现象 在相应的基因碱基序列没有发生变化的情 况下，一些生物体的表型却发生了改变。 什么是表观遗传学 ? 是 DNA 及其染色质环境的稳定改变，这些可遗传的 变化并不涉及 DNA 序列的突变。 表观遗传修饰 在不影响 DNA 序列的情况下改变基因组的修饰，不仅 可以影响个体的发育，而且还可以遗传下去。这类变异被 称为“表观遗传修饰”，并被认为是导致遗传物质一致的 孪生子出现个体差异的主要原因。 染色质重塑 ? 染色质重塑在广义上是指染色质结构的动态调整或重新塑 造染色质结构。在一些核内因子作用下，染色质 DNA 与 其包绕的 核心组蛋白 之间亲和力的变化或相对位置的改变 使得染色质结构变得较为松散， DNA 更易于暴露。染色 质重塑就是通过这样的变化来调控基因的转录。 ? 在狭义上，染色质重塑专指由 ATP 提供能量的、通过依赖 于 ATP 的染色质重塑复合物改变组蛋白与 DNA 的结合状 态，在靠近核心组蛋白的 DNA 表面建立特殊的构象，使 转录因子较易于接近 DNA 的过程。 染色质免疫沉淀技术的发展使染色质重塑研究得以进步 实验目的 学习掌握染色质免疫沉淀技术的基本原理与关 键的操作步骤。 实验原理 实验流程 一、交联及染色质 DNA 剪切条件的优化 1. 准备一瓶接近长满的 HeLa 细胞，向培养液中加入 37% 的甲醛至终浓 度为 1% ，轻轻摇匀，在 37 ℃ 孵育 10 分钟 。 ① 甲醛的作用 ② 细胞的用量 ③ 交联条件对实验结果的影响 2. 弃培养液，用预冷至 4 ℃ 带蛋白酶抑制剂 PMSF 的 1 × PBS 洗细胞两 次，刮细胞到一个 2ml 离心管， 2000rpm ， 4 ℃ 离心 4min 收集细胞。 甲醛的作用 在各种交联试剂中，甲醛（ HCHO ）的应用最为广泛。甲醛的浓度、 作用时间及交联的温度等均可能影响交联的程度。甲醛可以通过赖氨酸、 精氨酸和组氨酸以及那些 DNA 的氨基和亚氨基基团之间的交联，高效地 在体内交联蛋白质 -DNA 、蛋白质 -RNA 以及蛋白质 - 蛋白质，形成生物复 合体，防止细胞内组分的重新分布。除此之外， HCHO 可以忠实地保留 染色质结构，而且在温和条件下交联很容易逆转。通常交联所用的甲醛 终浓度为 1% ，在 12-37 ℃ 作用 30min 。但是如果反应温度超过 30 ℃ ，本底 就可能增加。因此，当必须在高温进行交联时，则应减少作用时间或甲 醛浓度。过度交联将影响细胞的裂解，并且在超声处理时不能获得理想 长度的 DNA 片段及影响 DNA 的溶解。对于特别容易进行交联的目的蛋白 质（例如，组蛋白）需减少交联时间或甲醛浓度。甲醛的交联反应可被 加入的甘氨酸终止。 细胞的用量 通常 2.5 × 10 8 细胞足够进行 4 次免疫沉淀。因此，一般为了保证用量， 采取培养多瓶细胞，胰酶消化，收集在 50ml 离心管中，培养液重悬，计 数。（一般分装 1х10 7 细胞于一个 EP 管，用于免疫沉淀反应）。 交联条件对实验结果的影响 对于不同的细胞类型，甲醛的浓度、交联的长度或者交联的温度都 需要调整。如果交联不充分，会导致不完全固定，则 DNA 片段的平均长 度会小于 500bp 。交联过度时细胞染色质难以用超声波破碎，就算延长 超声波作用时间也会导致重要原料的丢失。交联时间如果过短，则交联 不完全，产生假阴性，交联时间通常为 5 分钟到 1 个小时，具体时间根据 实验而定。 3. 用 500μl 预热至室温带有蛋白酶抑制剂的 SDS 裂解液 重悬并裂解细胞，冰浴 10 分钟； 4. 超声波处理剪切染色质 DNA ，使其形成 300-1000 bp 即大约相当于 2-5 个核小体长度的片段； ① 超声条件对实验的影响及超声注意事项 ② 设置超声破碎的条件 ③ 酶消化与超声消化相比较的区别 ① 超声条件对实验的影响及超声注意事项 超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生 泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响 ChIP 的效率。 所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时 断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深 入管中，但不接