基因组dna提取与pcr技术.pptVIP

5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 6、引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。 7、引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以这种引物参与的PCR反应产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。 （二）引物设计的方法 现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，在线引物设计的网站有： ––; ; ; ; 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至