11.4生物制品分析-免疫.pdf

生物制品分析方法 三、免疫分析法(immunoassay，IA) 微生物在药学中的应用 分析基础：基于抗原和抗体特征性反应。 特点：选择性高，检测限极低。 用途：临床、生物制药和环境化学等领域。 （一）免疫鉴定法—— 1.免疫印迹法 检查法 1 ）SDS进行电泳，分离蛋白； 2 ）凝胶中蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上； 3 ）维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体 作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。 （一）免疫鉴定法—— 1.免疫印迹法 免疫印迹法具有分析容量大、敏 感度高、特异性强等优点，是检测 蛋白质特性、表达与分布的一种最 常用的方法，如组织抗原的定性定 量检测、多肽分子的质量测定及病 毒的抗体或抗原检测等。 （一）免疫鉴定法——2. 免疫双扩散法 原理： 1.在打有特定小孔的琼脂板上，在相邻的两孔内分别加入抗原和抗体。 2.相对应的抗原、抗体在适宜的浓度、比例下，相互扩散。 3.一定时间后，在抗原和抗体孔之间形成免疫复合物的沉淀线。 （一）免疫鉴定法——2. 免疫双扩散法 用已知抗体 ( 或抗原 ) 检测未知抗原 ( 或抗体 ) ，可鉴定抗原性物质或免疫血 清的浓度、纯度及比较抗原之间的异同点。 （一）免疫鉴定法—— 3. 免疫电泳法 免疫电泳法是在凝胶介质中将电泳法与扩散法相结合的一种免疫化学方法，用 以研究抗原和抗体。 原理： 1.通过琼脂凝胶电泳将供试品中的各蛋白抗原组分分成不同的区带。 2. 各抗原与相应的抗体进行双向免疫扩散。 3. 抗原扩散与抗体形成可见的沉淀弧，鉴定抗原。 （一）免疫鉴定法—— 3. 免疫电泳法 （二）免疫分析法——1.放射免疫分析法(RIA) 利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位 素体外微量分析方法。 原理：以放射性同位素为示踪物，结合免疫反应进行分析。 *Ag *Ag-Ab 标记抗原 标记抗原抗体复合物 特异性抗体 Ab Ag Ag-Ab 非标记抗原 非标记抗原抗体复合物 （二）免疫分析法——1.放射免疫分析法(RIA) 放射性同位素标记的抗原，其免疫决定簇未受很大影响情况下，仍能与抗体结 合。当一定限量的抗体（Ab ）存在于体系时，体系中标记抗原（Ag* ）与未标记 抗原（Ag ）就竞争地与抗体结合分别形成标记抗原－抗体结合物（Ag*-Ab ）与 未标记抗原－抗体结合物（Ag-Ab ）。测定抗体结合物和未结合的抗原的放射性 强度，可计算样品中抗原Ag的量。 （二）免疫分析法——2.酶免疫分析法(EIA) 酶免疫分析是一种非放射性标记免疫分析技术，以酶标记抗原或抗体作为示 踪物，由高活性的酶催化底物显色或发光，达到定量分析的目的。酶免疫分析法 形式多样，商品化产品较多，应用广泛。 以双抗体夹心法为例，其测定抗原的原理和操作如下： 1.将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质 。 （二）免疫分析法——2.酶免疫分析法(EIA) 2.加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上 的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 3.加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶 标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 4.加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量。 （二）免疫分析法——2.酶免疫分析法(EIA) （二）免疫分析法—— 3. 化学发光免疫分析 （CLEIA） 化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。 化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化