分子生物的学的方法.pptVIP

分子生物学研究方法 1、重组DNA技术发展史上的重大事件 2、DNA操作技术 3、基因克隆的主要载体系统 4、基因的分离与鉴定  分子生物学从20世纪中叶开始高速发展, 最主要的原因之一是基因操作和基因工 程技术的进步。基因操作:DNA的切割 和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细 胞转化、核酸序列分析、基因的人工合 成、定点突变和PcR扩增。这是分子生 物学研究的核心技术。基因工程:在体 外将核酸分子插入载体分子中,使之进 入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和 表达。  ☆跨越天然物种屏障、把来自任何生 物的基因置于毫无亲缘关系的新的 寄主生物细胞之中的能力,是基因 工程技术区别于其他技术的根本特 征。本章将在回顾重组DNA技术史 上主要事件的基础上,讨论DNA操 作技术、基因克隆的常用载体系统 以及基因的分离与鉴定等3个环节。  51重组DNA技术史上的重大事件 半个世纪以来,分子生物学研究取得了前所 未有的进步,主要有3大成就:第一,解决了 遗传的物质基础问题一一基因的分子载体是 DNA;第二,DNA分子的双螺旋结构模型和 半保留复制机制,解决了基因的自我复制和 世代交替问题;第三,“中心法则”和操纵子 学说,成功地破译了遗传密码,阐明了遗传 信息的流动与表达机制。  DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列 分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的 产生和发展 重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和 DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。 这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史 上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特 定碱基序列位点切开DNA。1972, Boyer实 验室发现核酸内切酶EcoR能特异识别 GAAUC序列,将DNA在这个位点切开产生 具有粘性末端的小片段  他们还发现,EcOH酶切产生的任何不 同来源的DNA片段能通过粘性末端之间 碱基互补作用而彼此“粘合”起来。 此后,大量类似于ErOR但具有独特识 别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目 前为止,科学家已经几乎能随心所欲地 把任何DNA分子切割成一系列不连续的 片段,再利用凝胶电冰技术将这些片段 按照分子量大小逐一分开,以供下一步 研究。  (5AAGCT T(3) Ban I (5GGATCC() TTCGAA CCTAGG (5GCGGCCGC (5ATCGAT(3) CGCCGGCG TAGCTA Pst I (5CTGCAG(3) EcoRI (5GAATTC(3) GACGTC CTTAAG (5CAGCTG() GTCGAC Eco Rv (5GATATC (3) CTATAG Tth 1111 (5GACNNNGTC(3) (5)GGCC() CTGNNNCAG CCGG 图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端  衰5-2量组DNA实验中常见的主要工具 功能 限制性核酸内切酶 识别并在特定位点切开DNA 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA DNA连接酶 分子 DNA聚合酶I(大肠杆菌)按5到3方向加入新的核苷酸补平DNA双链中的缺囗 反转录酶 按照RNA分子中的碱基序列,根据碱基互补原则合成 DNA链 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH末端(进行末端 多核苷酸激酶 标记实验或用来进行DNA的连接) 末端转移酶 在双链核酸的3末端加上多聚单核苷酸 DNA外切酶Ⅲ 从DNA链的3末端逐个切除单核苷酸 λ噬菌体DNA外切酶 从DNA链的5末端逐个切除单核苷酸 碱性磷酸酯酶 切除位于DNA链5或3末端的磷酸基团  52DNA操作技术 植物基因组DNA的提取:液氮对植 物组织进行研磨一一破碎细胞。细 胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白 而破坏细胞膜,使蛋白质变性而沉 淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。 再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白, 得到的DNA溶液经乙醇沉淀。  冷材料1·三羟甲基氨基甲烷(Tis)2·乙二胺 四乙酸(EDTA)3·氯化钠4β—巯基乙醇 5·氯化钾6·异丙醇7·乙醇8·琼脂糖 9十二烷基硫酸钠(SDS)10·EP管11,陶 瓷研钵12·加样枪和吸头13·氯仿14·酚 试剂1·细胞提取液(100mmoL Tris. HC|=50/26.8pH8·0)(100mL分装为 10mL), 5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaC|1.25% SDS Imol/Lβ一琉基乙醇 2. 5mol/L KCl