生物制药工艺技术 基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌的发酵工艺.docVIP

《生物制药工艺技术》 1 - 课程教学方案 教师： 授课专业 生物技术及应用、生物制药技术 上课地点 多媒体教室 授课时间 学习内容 学习情境4 微生物工程菌发酵制药技术 基因工程菌的发酵工艺 课时 8 教学目标 知识目标 掌握基因工程菌的发酵工艺。 技能目标 能从事基因工程菌的发酵生产。 素质目标 精细规范操作、有安全意识、环保意识。 教学重点难点 重点：基因工程菌的发酵工艺要点。 难点：基因工程菌的发酵生产。 目标群体 学生在前面学习了《应用微生物基础》，《生物化学》的具备了微生物生理特点及代谢的基础知识。 教学环境 教室、实训室 教学方法 1、理论讲授 2、实训课：讲授、演示与学生操作，教学做一体化 时间安排 教学过程设计 [ 课型 ] 理论课：多媒体辅助讲授 [组织教学] 课前5分钟演讲或安全教育 [教授新课] 学习情境4 微生物工程菌发酵制药技术 基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同,基因工程菌带外源基因,发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。 工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有： （1）培养基的影响 （2）接种量的影响 （3）温度的影响 （4）溶解氧的影响 （5）诱导时机的影响 ( 6 ) pH的影响 ( 1 ) 培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达，还要考虑到目的产物提取纯化的因素。 尤其是生产人 畜体内蛋白质的发酵，对培养基使用的原材料的质量要求较高，最好采用具有一定选择压力的合成培养基。不宜采用传统发酵的高营养性培养基。 ( 2 ) 溶解氧的影响 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，要求有足够的溶氧，特别是高密度发酵。 但应根据使用的菌株和表达产物的需要来控制。 ( 3 ) 比生长速率 菌体的比生长速率与代谢产物的表达密切相关。比生长速率太大，超过某一值，易产生乙酸，这一比生长速率值称为菌体的乙酸产生临界比生长速率。通过考察得出最优比生长速率，控制溶氧、转速、补糖来控制比生长速率。 （4）诱导时机的影响 诱导时间：加入诱导剂后的培养时间 随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。 诱导时机指加入诱导剂的时间 以天冬酰氨酶表达为例，在A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶活和表达水平都较高。而菌体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗，及代谢产物的积累，使菌体的生长速度受到抑制。在此状态下诱导，表达显然受到影响。 （5） pH的影响 在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白的表达不利，因此，表达时要调节pH在6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表达。 总之,最佳化的工艺是获得: 最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。 基因工程菌的培养设备 应用发酵罐大规模培养基因工程菌。它不同于微生物发酵，微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标，而基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物。 发酵罐的组成有： 发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统。 既要防止外界微生物的侵入，又必须不使重组体外漏。 对发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染， 保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物，不能干扰细菌代谢活动等。 工程菌的安全性 基因工程药物的分离纯化 生物技术产品一般是活性肽或蛋白质，它们具有如下特点： ①初始物料中含量低； ②基体组成复杂； ③稳定性差； ④种类多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂而又性质各异的生物活性物质； ⑤应用面广，要求质量、纯度高，无菌无热源等。 一、建立分离纯化工艺的根据 1、含目的产物的起始物料的特点 2、物料中杂质的种类和性质 3、目的产物特性 4、产品质量要求 二、分离纯化的基本过程 一般包括如下几个方面的过程：细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。书中给出了流程示意图（图3-7）。 三、分离纯化的技术 分离纯化要求：条件温和、