第八章 免疫学检测方法课堂.pptVIP

间接 ELISA 31 间接酶联免疫吸附试验 操作步骤如下： （ 1 ）分别以不同单抗为第一抗体，加在血细胞抗原上。37℃湿盒中孵育 60min 。 （ 2 ） 0.01M PBS 洗三次，每次 5min 。 （ 3 ）加 AP-IgG 为第二抗体，37℃湿盒中孵育 45min 。 （ 4 ） 0.01M PBS 洗三次，每次 5min 。 （ 5 ）加 NBT/BCIP 底物缓冲液发色 10min ， （ 6 ）出现颜色加终止液终止反应。 （ 7 ）用酶标分析仪在 405nm, 处测定各孔的吸光度，计算 P ／ N （样品光吸收值 与阴性对照的值），判定 ELISA 反应结果。大于 2.1 时可判断为阳性。 以最大显色至阳性的显色孔 50% 反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价 。 32 33 图 DOT BLOT 方法筛选结果图。 34 免疫组织化学方法定扇贝血细胞分布 35 细胞免疫化学法检测病毒感染 36 四、 Western blot 是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法 。 原理及步骤 样品 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白 （ SDS) 转移（印迹）于硝酸纤维素膜 加抗体检测某种特异性蛋白质 37 West Blot 38 图：淋巴囊肿病毒与抗血清的 Western blotting 结果 39 40 免疫电镜技术 免疫电镜技术（ immune electron microscopic technique ） 是一种将免疫学技术与电子显微镜技术相结合的血清学方 法，能使抗原在分子水平上进行定位。它实际上是将细胞 水平的荧光抗体技术的基本原理应用于分子水平上。这一 技术的发明使抗原和抗体的定位研究达到了亚细胞或分子 水平。主要有以下几种技术。 ? 铁蛋白抗体法 ? 酶标记抗体法 ? 重金属标记抗体法 41 图 胶体金标记免疫电镜结果 [(A) (D) bar = 200 nm; (B) (C) bar = 100 nm] 42 胶体金免疫技术 ? 胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸 等作用下的水溶液，具有高电子密度，并能 与多种大分子发生物理吸附，因此，不但所 有的大分子物质都可被金标记，而且标记后 大分子物质活性不发生改变。 ? 当抗原和金标抗体反应时，肉眼可见红色或 粉红色斑条（点） , 在显微镜下观察，抗原 抗体结合处为黑褐色的颗粒。 43 斑点免疫金渗滤法（ DIGFA ）的应用 与研究进展 是 20 世纪八十年代发展起来的一种免疫学检 测方法，具有简便、快速、准确等优点。目前在 医学检验中主要应用于检测 HBsAg 、 HCG 和 HIV 等。 44 斑点免疫金渗滤法原理 ： NCM 为固相载体 通过渗滤 抗原与抗 体在膜上快速反应 标记的胶体金堆积显 色。 胶体金 抗体 抗原 NCM 吸水垫 45 临床应用： ? 间接法测抗体： NCM 抗原 样品抗体 金标抗抗体显 色 ? 夹心法测抗原 ： NCM 多抗 样品抗原 金标单抗显色。 46 直接法检测抗原 NCM 病毒 金标单抗显色 DIGFA 步骤简化、时间缩短。 47 ? DIGFA 检测操作程序 a. 2μ l 检测样品 NCM 直径 2mm 点 晾干； 100μ l 封闭液，渗入； 100μ l 的金标抗体，渗入； e. 100μ l 的 0.01M PBS-T （含 0.05%Tween-20 ）， 渗入； 检测结果： 红色斑点的为阳性，无红色斑点的为阴 性 。 阳性代表检测样品中有病毒，阴性 48 DIGFA 检测结果 , 红色斑点的为病毒阳性 , 无红色斑点的为病毒阴性。 The result of DIGFA, red dot shows there is WSSV, otherwise, there is no WSSV. 49 ? 免疫学技术是利用抗原抗体特异性反应 的原理建立的各种检测与分析技术，以 及建立这些技术的各种制备方法。 第八章 免疫学检测方法 1 2 3 检测技术种类 一、 免疫学检测 ? 免疫凝集试验 ? 免疫沉淀试验 ? 酶联免疫试验 ? 荧光免疫技术 ? 免疫电镜技术 ? 免疫印迹试验 4 5 细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应 中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素 。 凝集法测定哈维氏弧菌抗体的效价 管号 1 2 3 4 5 6 7 磷酸盐缓冲液 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 1.0 兔抗 X 菌血清 0.1 0.1(1 ) 0.1( 2) 0.1( 3) 0.1( 4) 0.1(5 ) 0.0 1. 稀释抗体 2. 玻片凝集法 A. 用 1ml 移液枪取 6 号离心管中的溶液一滴滴在载玻片的一端，另一端加一滴 磷酸盐缓冲液，然后分别加一滴准备