《生物化学》教学课件：第19章组学a.pptVIP

* * * * * * * * * * * * Structure and expertise in the PROSPECTS network. An overview of third generation proteomics applied to cell biology. Protein localization, turnover, modifications, isoforms, absolute and relative abundance, PTM, post-translational modifications can increasingly be studied in relation to each other. * 1-4 等电聚焦 Iso-electric focusing, IEF 蛋白质首先根据等电点pI的不同在一向等电聚焦电泳中分离 全细胞裂解的大多数蛋白质的pI为4－9（约70％），但也有相当数量的蛋白质pI超过12。 * Applying the rehydration solution into the strip holder Positioning the IPG strip * Position the IPG strip between the plates on the surface of the second-dimension gel * Two-dimensional gel electrophoresis, a technique for separating proteins based on their charge and their mass. * 等电聚焦后胶条被转移到第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同被分离 * 1-4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质具有不同分子量而被分离 * Proteins from E. coli 经过染色才能看见的2D图 考马斯亮蓝 银染 锌染 荧光染色 放射性同位素 蛋白质的显示方法 * 低丰度蛋白的检测 膜蛋白的检测 极酸、极碱蛋白质的分离与检测 有限的动态范围 疏水性蛋白质的检测 相对分子质量大于100 kDa小于10 kDa的蛋白质的丢失 重复性问题 自动化问题 双向凝胶电泳的局限 * 速度快，一般几个小时可完成全部分离，而2-DE分离一般需1～ 2 天； 溶液状态样品处理方便、快速，避免了2-DE从胶上回收样品的繁复操作，分析过程易于自动化和与质谱联接； 对各种蛋白质均适用，包括疏水性、酸性、碱性，相对分子质量大于100kDa、小于 10 kDa的蛋白质等 二维色谱分离蛋白质有多种组合模式，第一维色谱一般用离子交换色谱，也有用凝胶过滤色谱；第二维通常是反相色谱。 反相色谱采用有机溶剂作流动相，避免盐等添加剂对后续质谱分析的影响。 (二) 非凝胶技术 用于蛋白质组学研究的新型分离模式主要包括高效液相色谱、毛细管电泳等一维和多维的非凝胶技术，这些技术表现出了高效、快速、自动化程度高、灵敏度高、检测限低等优点，可以大大简化蛋白质组学的研究步骤。 * What can I know? * 各类蛋白质样品制备技术 蛋白质分离技术 蛋白质鉴定技术 蛋白质组研究的定量方法 对分离的蛋白进行鉴定 ——图像分析技术、质谱技术(鉴定原理） 蛋白质组学-SILAC技术研究细胞核仁蛋白质组成及动态的变化 SILAC: Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture Cells are metabolically labelled Basic steps in a proteomic Assay Purification of protein complex or subnuclear structure Protein separation Protein identification(peptide mass fingerprinting and mass spectrometry) Bioinformatics (cross reference of protein informatics with genomic databases) Protein characterization(expression in bacteria and mammalian cells, abs generation, etc) Simplified SILAC Experimental Procedure SILAC-the application Determination of nucleo