药品生物检定技术 3.4 病毒繁殖与培养 项目四-8-病毒繁殖与培养 教案.docVIP

药品质量与安全专业教学资源库 《药品生物检定技术》教案 知识点 病毒繁殖与培养 学时 0.5学时 教学内容 病毒繁殖过程；动物培养法；禽胚培养法；细胞培养法 教学重点 病毒繁殖过程 教学难点 禽胚接种法 禽胚培养法 参考资料 药品微生物检验技术 主编：孙祎敏 中国医药科技出版社 微生物检测技术 主编：叶磊 化学工业出版社 药用微生物技术 主编：郝乾坤 重庆大学出版社 病毒的概念： 病毒由一个 核酸分子（DNA或RNA）与 蛋白质构成或仅由 蛋白质构成（如 朊病毒）。病毒个体微小，结构简单。病毒没有细胞结构，由于没有实现新陈代谢所必需的基本系统，所以病毒自身不能复制。 病毒的繁殖： 病毒体在细胞外是处于静止状态，基本上与无生命的物质相似，当病毒进入活细胞后便发挥其生物活性。由于病毒缺少完整的酶系统，不具有合成自身成份的原料和能量，也没有核糖体，因此决定了它的专性寄生性，必须侵入易感的宿主细胞，依靠宿主细胞的酶系统、原料和能量复制病毒的核酸，借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质。病毒这种增殖的方式叫做“复制”。病毒复制的过程分为吸附、侵入脱壳、生物合成及装配释放四个步骤，又称复制周期（图5-15）。 图5-15 病毒T4噬菌体的增殖过程 吸附 吸附指病毒以其特色结构与寄主细胞表面的特异受体发生特异结合的过程，它是感染的起始期。特异性吸附是非常重要的，根据这一点可确定许多病毒的宿主范围，不吸附就不能引起感染。细胞与病毒相互作用最初是偶然碰撞和静电作用，这是可逆的联结。如脊髓灰质炎病毒的细胞表面受体是免疫球蛋白超家族，在非灵长类细胞上没有发现此受体，而猴肾细胞、 Hela细胞和人二倍体纤维母细胞上有它的受体，故脊髓来质炎病毒能感染人体鼻、咽、肠和脊髓前角细胞，引起脊髓灰质炎（小儿麻痹）。 侵入脱壳 穿入是指病毒核酸或感染性核衣壳穿过细胞进入胞浆，开始病毒感染的过程。主要有三种方式：①融合，在细胞膜表面病毒囊膜与细胞膜融合，病毒的核衣壳进入胞浆；②胞饮，由于细胞膜内陷整个病毒被吞饮入胞内形成囊泡，是病毒穿入的常见方式；③蛋白水解酶敏感，病毒核酸可直接穿越细胞膜到细胞浆中，而大部分蛋白衣壳仍留在胞膜外，这种进入的方式较为少见。 生物合成 病毒的生物合成是指病毒在寄生细胞内合成病毒蛋白质，并复制核酸的过程。大部分DNA病毒在宿主细胞核内合成DNA，在细胞质内合成蛋白质，绝大部分RNA病毒的RNA和蛋白质都在细胞质中合成，也有少数例外。 装配释放 新合成的病毒核酸和病毒结构蛋白在感染细胞内组合成病毒颗粒的过程称为装配，而从细胞内转移到细胞外的过程为释放。感染后6小时，一个细胞 动物接种 ：这是最原始的病毒培养方法。常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔，有时也用猴、猿、猩猩等。对于动物的选择，应满足一下标准：①大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗的健康动物；②对相应病毒易感，并十分敏感；③家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确，并符合普通级实验动物标准；④动物的体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。病毒。按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径，有鼻内、皮下、皮内、脑内、腹腔内、静脉等，如嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。接种后通常以动物发病、死亡作为感染指标。此接种方法不需要复杂的仪器设备，且结束简单，易成功，然而其存在个体差异大、价格昂贵、需要隔离畜舍等缺点。 禽胚培养法： 鸡胚接种 该方法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。根据病毒种类不同，可将病毒样本接种于鸡胚的羊膜腔、绒毛尿囊膜、尿囊腔、卵黄囊中（图5-18）。①羊膜腔接种，应用于从临床材料中分离流感病毒等，病毒感染后可收集羊水和尿囊液。②绒毛尿囊膜接种，常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离，这些病毒能够在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见的斑点或痘疱状病灶。另外，病毒可在绒毛尿囊膜上进行滴定，通过产生的班和痘来计算病毒颗粒的数目。③尿囊腔接种，应用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养。这些病毒被接种到尿腔囊后，可在内皮细胞中复制，复制的病毒被释放到尿囊液中。因此，在尿囊液中含有大量的病毒。④卵黄囊接种，主要用于虫媒病毒、衣原体及立克次体等的分离和繁殖。这些大的病原体主要在卵黄囊的内皮细胞生长，且生长速度很快，立克次体染色后也可看到。 图5-18 鸡胚接种部位示意图 影响禽胚增殖病毒的因素主要有： （1）禽胚的质量，直接影响病毒增殖的数量和质量。 ①病原微生物：很多家禽传染病病原 可以垂直传播，如白血病病毒、脑脊髓炎病毒、腺病毒、支原体等。这些病原既可以污染制品本身