【课件-实用生物医学实验技术】_荧光定量PCR技术.ppt

误差控制 使用Master mix 配置预混体系 设置生物学重复（不同个体） 技术性重复（复孔） 阳性和阴性对照 实验环境控制 试剂准备区 核酸制备区 反应液制备区 荧光定量PCR反应区 荧光定量PCR体系 数据分析 融解曲线：单一特异性产物 扩增曲线： -- Ct值大小 -- 各复孔之间重复性 -- 不同浓度梯度稀释的间隔性 标准曲线： -- R2＞0.980或∣ r ∣ ＞0.990 -- 反应效率尽可能高：90%-110% -- 目的基因的扩增效率接近内参基因 Trouble shooting 常见问题 可能原因 解决方法 Housekeeping gene 无信号 RNA降解 用新鲜组织提取RNA Housekeeping gene 有信号 而目标基因无信号 1. 目的基因表达低。 逆转录效率不高 2. PCR引物不良 1. 富集mRNA 2. 在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。 3. 尝试不同PCR引物。减小产物大小，改换目标 区段，考虑不同剪接体。 4. 尝试不同热循程序，降低复性温度。 Housekeeping gene 反应效率正常,但 目标因放大效率不高 PCR引物不良 重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段， 考虑不同剪接体 目标基因表达丰度在 样本之间异常一致 RNA被基因组DNA污染 使用跨intron 引物 用DNase处理RNA 确保RNA阴性对照表现阴性 溶解曲线出现杂峰 出现非特异PCR产物 出现引物二聚体 尝试不同PCR引物 尝试不同热循程序，升高复性温度 修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链温度与PCR特异产物解链温度之间。 阴性对照在30个循环 以内出现信号 试剂被污染 注意区分信号是来自引物二聚体还是PCR产物 查找，替换污染试剂 使用UNG系统。 案例分析 总体原则 偶然因素 -- 操作原因 实验重复 – 生物学重复、技术性重复 机器因素– 仪器加样孔 结合扩增曲线、融解曲线、标准曲线分析 单孔和多孔分析 内参基因和目的基因对比分析 Ct 值(Cycle Threshold) Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。 起始模板量 基线 阈值 Ct值 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动很大，但Ct值相对固定； Ct值则极具重现性 Ct 值(Cycle Threshold) Ct值可以确定初始模板量？ Rn=RB+ X0 (1+E)N * RS 第n个循环的总信号 =本底信号 + 起始DNA数目 * PCR扩增效率 * 单位信号强度 当循环次数n=Ct时 RCt=RB+ X0 (1+E)Ct * RS 两边同时取对数得: lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRS Ct=-lgX0/lg(1+E)+ lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E) Ct=-klgX0+b lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。  荧光定量PCR检测方法 染料标记： SYBR Green Super green 探针标记： 水解探针： TaqMan 非水解探针：Molecular beacon SYBR Green I 工作原理 SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，最大吸收波长约为497nm ，发射波长最大约为520nm。 SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光。 荧光信号与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加。 荧光信号强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG Emission Excitation -- 变性时，DNA双链分开，无荧光信号。 -- 延伸结束时，采集荧光信号。 SYBR Green I 工作原理 优点： 使用方便，成本低 -- 仅需设计两个引物 通用性好 -- 对DNA模板没有选择性 需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。 缺点： SYBR Green与所有双链DNA结合 -- 引物二聚体或错误扩增产物造成假阳性 -- 只能检测单