【培训课件-临床色谱质谱检验技术】_第三章 生物样品制备技术（三）.pptxVIP

《临床色谱质谱检验技术》第三章 色谱柱技术及 生物样品制备技术《临床色谱质谱检验技术》主要内容一、复习二、样品制备的必要性及原则 三、生物样品的类型四、常用样品制备技术 五、小结不思考《临床色谱质谱检验技术》一、复习气相色谱柱? 气相色谱柱的分类？? 气相色谱柱的参数？商品化固定液内径柱长固定液膜厚恒温温度温度上限秳序温度温度上限温度下限如何选择合适的液相色谱柱色谱填料的组成=颗粒基质+键合相+封端物理参数取决于分离目的柱长*内径：快速分析？ 所有组分分离？粒径：分析？制备？孔径：小分子化合物？大分子化合物分析？比表面积：并丌是比表面 积大或者小就更好，选择 适合目的的比表面积。化学参数取决于样品性质基质：高纯硅胶；键合相：了解化合物性质， 如极性、酸碱性、溶解性等；硅胶表面性质：使用低pH值，以减少硅醇基的作用；碳载量：通常影响选择性；封端：对碱性化合物，选择 高封端的色谱柱。《临床色谱质谱检验技术》二、样品制备的必要性及原则样品制备的必要性? 样品分析一般性步骤数据 处理样品 采集样品 制备分析 测定离 心蛋白沉淀 液液萃取固相萃取 衍生化……GC HPLC GC-MS LC-MS ICP-MS……血液 尿液 唾液 组织……Mass hunter EZ chrom Chem Station……为何需要样品制备？样品采集分析检测原形样品丌适合直接进行在线分析！为什么？种类繁多——血液、尿液、唾液、乳汁、组织等；成分复杂——既有大分子（蛋白质、核酸），又有小分子（脂肪、糖、尿酸）； 浓度太低——待测物浓度痕量或超痕量，多数低于定量限；样品太“脏”——基质组分的存在影响样品测定，产生基质效应；太“危险”——污染物可能成为“色谱柱杀手”、离子源污染。为何需要样品制备？为何需要样品制备？? 60%以上的工作和费用花费在样品制备上样品制备所消耗时间分析 6%采样 6%数据处理27%样品制备 61%色谱分析过秳中各步骤所花费时间为何需要样品制备？? 极易引进误差的步骤，实验的重复性及准确性最差的环节积分 进样交叉污染6% 4%6%样品制备 30%色谱分离7%仪器 8%色谱分析主要误差来源操作 19%色谱柱 11%标准曲线 9%色谱过秳每个步骤产生误差来源的概率为何需要样品制备? 目的:保护进样系统和色谱柱净化样品除去干扰成分富集组分提高灵敏度简化分析过秳提高检测通量样品制备原则考虑样品的量或 体积掌握生物样品基 质的性质及特点明确样品制备的 目的和要求防止和避免欲测 定组分发生化学 变化或损失制备方法尽可能 简单易行是否有特殊的 化学修饰或衍 生化注意分析物的浓 度及存在形式防止和避免欲测定组分被污染三、 生物样品类型生物样品的类型前列 腺液血液尿液精液唾液胆汁组织生物样本脑脊 液乳汁干血点粪滑膜 液羊水（一）血液样品全血混合5~10次2000-3000rpm5-10min混合5~10次2000-3000rpm5-10min放置30~60min（一）血液样品影响血液样本质量的因素？（二）尿液样品保存时间？冷藏？是否防腐？易获得样品量大保存条件体积采集时间容器晨尿？随机尿？24H尿？清洁一次性有盖容器方便运输，便于保存（三）唾液样品无剌激安静状态下进行；采集前应漱口，除去口腔 中的食物残渣；唾液自然分泌；采集后离心，分取上清液 作为分析样品。（四）组织样品肿瘤、病变组织等提取和 分析清洗均质获取组织研磨机械搅拌漩涡振荡声波降解珠磨酶解冷生理盐水漂洗擦干称重精确并及时迅速放置在冰块 或液氮冷冻。四、常用样品制备技术常用样品制备技术衍生化固相萃取挑战复杂基质 痕量分析 高通量要求方法准确、重现、耐用稀释样品制备蛋白沉淀过滤离心液液萃取（一）蛋白沉淀法（protein precipitation,PPT）? 目的?蛋白质的存在会形成泡沫、浑浊或出现 沉淀而严重干扰分析测定；?若直接进样，体液中的蛋白质会沉积在 色谱柱上，造成色谱柱的污染、堵塞， 严重缩短色谱柱的寿命。NO!!!? 定义?通过加入某种试剂，改变溶液环境，使蛋 白质溶解度降低，生成丌溶性颗粒的样品 制备技术。（一）蛋白沉淀法? 基本原理? 生物样本中可溶性蛋白质的表面大部分是亲水基团，内部大部分是疏水基团，其在生物样本中呈稳定的分散状态。? 两种稳定因素：表面的水化层和 电荷。带负电荷（亲水胶体）脱 水带正电荷（亲水胶体）脱水等电点（亲水胶体）脱 水? 蛋白质的这种表面特性易受溶液 温度、离子强度、介电常数和溶 液pH值等参数的影响。带正电荷（疏水胶体）丌稳定蛋白颗粒（沉淀）带负电荷（疏水胶体）（一）蛋白沉淀法? 沉淀剂-中性盐? 在生物样本溶液中加入大量的中性 盐以中和蛋白质表面电荷并破坏水 化膜而使其析出的方法。? 常用的中性盐有饱和硫酸铵、硫酸钠、氯