microRNA-10b-5p对成肌细胞增殖、分化和迁移的遗传作用研究.pdfVIP

摘 要 microRNAs(miRNAs)是一类广泛存在于真核生物中长度约22nt、高度保守的小 RNA mRNAs 3’UTR mRNAs 分子非编码 ，通常与其靶基因 的 区域结合而导致 降解 或抑制其转录后翻译，其几乎参与所有的生物学功能调控。骨骼肌约占个体重的 30-40％，是机体新陈代谢的活动中心，也是肉用动物的主要经济性状之一。但是， 目前对于miRNAs在骨骼肌发育过程中的表观调控机制还不太清楚。本实验室基于前 期高通量测序结果，发现miR-10b-5p 在猪骨骼肌中表达量较高，但miR-10b-5p 对骨 骼肌发育的影响及其调控机制还未见报道。因此，本试验运用C2C12 成肌细胞作为 研究模型，通过过表达或抑制表达miR-10b-5p 来探究其对成肌细胞增殖、分化及迁 移的影响作用。并进一步通过双荧光素酶报告系统和小干扰 RNA 技术验证 miR-10b-5p 的靶基因以及作用的下游调控网络，明确miR-10b-5p 在调控成肌细胞增 殖和分化的遗传调控过程中的作用。主要研究结果如下： (1)miR-10b-5p 在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、脂肪组织中均有表达，并且 肌肉组织中的表达量相对较高。同时，miR-10b-5p 的表达量存在一定的时序性，其 表达水平在C2C12 成肌细胞的增殖过程中逐渐下降，而在其分化过程中显著升高。 (2) CCK8 EdU miR-10b-5p 根据用于测定细胞增殖能力的 和 试剂盒测定结果，发现 能够显著促进C2C12 成肌细胞的增殖能力(P0.01)。在此过程中，miR-10b-5p 显著地 (CDK4 CyclinE CyclinD1 CyclinB)(P0.01) 促进了细胞周期蛋白相关基因表达 、 、 、 。 (3)通过MyHC免疫荧光染色试验发现miR-10b-5p 能够显著抑制成肌细胞的肌管 生成(P0.01)，进而降低其成肌分化能力。在此过程中，miR-10b-5p 显著地抑制了肌 (MyHC MyoD MyoG Myf5 MRF4) (P0.01) 源性分化标志基因 、 、 、 、 的表达 。 (4)通过细胞划痕试验发现，miR-10b-5p 能够显著促进C2C12 成肌细胞的迁移能 (P0.01) (Pax3 Fhl1 力 。在此过程中，显著地促进了成肌细胞迁移相关功能基因 、 和 Actg1)的表达(P0.01)。 (5) NFAT5 E2F7 miR-10b-5p 通过双荧光素酶报告系统的试验结果证明 和 是 的直 接靶基因。干扰NFAT5 的表达，显著抑制了成肌细胞的肌管生成(P0.01)。而干扰 E2F7的表达，则显著地促进了成肌细胞增殖(P0.01)。 上述研究结果表明miR-10b-5p 能够促进C2C12 成肌细胞的增殖及迁移，同时抑 miR-10b-5p E2F7 NFAT5 制成肌细胞分化。 通过直接靶向 和 调控肌生成相关的增殖 I 和分化过程。这些研究结果表明miR-10b-