PEDV SNJ-P株的分离鉴定与基因组学研究及S蛋白间接ELISA方法的建立.pdfVIP

摘 要 猪流行性腹泻( Porcine epidemic diarrhea ，PED) 是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus ，PEDV) 引起的一种急性传染病，可引起猪只急性腹泻并迅速 脱水、死亡，对哺乳仔猪危害最大。2010 年来，PED 在世界各地大规模暴发。毒株 变异是导致该疫情难以控制的主要原因之一。 本研究应用PK-15 细胞在腹泻哺乳仔猪肠道内容物中进行病毒分离，通过细胞病 变、RT-PCR 检测、琼脂糖凝胶扩散试验对细胞培养物进行鉴定，证明获得一株PEDV 毒株，命名为SNJ-P。该病毒可在胰酶终浓度为4 μg/mL 的病毒培养液中培养，盲传 至第4 代产生细胞病变。继续传代至第7 代，细胞稳定出现CPE 。传代至第10 代， 出现CPE 时间提前至接毒后12 h。将第15 代细胞病毒液收集进行蚀斑纯化，计算出 -6.5 SNJ-P 的TCID50 为1×10 / mL 。观察SNJ-P 人工感染哺乳仔猪后的病理学变化及检 测各组织器官内病毒核酸载量，制作主要病变器官病理切片。结果表明除肠道以外， 肺脏与肝脏内病毒核酸载量最高，呈肠道肺脏肝脏。 比对多条参考株全基因组序列，设计21 对扩增PEDV 全基因组序列的引物，扩 增SNJ-P 分离株的全基因序列。分析各基因片段遗传与变异情况，讨论变异可能造成 其产物功能上的变化，从基因层面分析目前疫苗免疫效果不理想原因，为新的疫苗的 研发提供理论帮助。建立全基因进化树，分析该毒株与参考毒株的分子遗传进化关系。 结果显示SNJ-P 与中国株ZL29 、CH/HNYF 的同源性最高，同源性为98.4%和98.7% 。 与俄罗斯株Blegorod 亲缘关系较远，同源性为90.9 ％。 对分离毒株的S 基因进行分析，设计了1 对引物扩增其抗原性较高的抗原决定簇 基因区（689~794 aa ），构建pET-32a （+ ）-SJ 重组表达质粒。诱导表达得到大小为 35 kD 的重组S 蛋白，鉴定其为包涵体，利用Ni-Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒对 该蛋白进行纯化，获得浓度为1.145 mg/mL 的重组蛋白。对其进行Western-blotting 鉴定，证明其具有良好的抗原性。 将纯化的重组蛋白作为包被抗原，优化各反应条件，建立检测PEDV 血清抗体的 间接ELISA 方法。判定标准为OD450nm≥0.324 为阳性，反之为阴性。与市售试剂盒符 合率为96.67 ％。该方法特异性良好，重复性高，且成本低。可用于临床PEDV 血清 抗体检测以及PEDV 流行病学的监测，对本病的预防具有重要意义。 关键词：猪流行性腹泻；分离鉴定；全基因测序分析；间接ELISA I Abstract Porcine epidemic diarrhea (PED) is an acute infectious disease caused by Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), which can cause acute diarrhea in pigs and rapidly dehydrate and die, which is harmful to suckling piglets. maximum. Since 2010, PED has exploded on a large scale around the world. Variation of the strain is one of the main reasons for the difficulty of controlling the epidemic. In this study, PK-15 cells were used for virus isolation in the intestinal contents of diarrhea suckling piglets. Cell cultures were ident