PRRSV NADC30-Like CJS01株的分离鉴定及其检测方法的建立应用.pdfVIP

摘 要 PRRSV NADC30-Like 毒株是近 5 年开始流行的毒株，部分地区尚未引起重视， 已在国内多地造成较大经济损失，故深入研究该类毒株病原特性与检测方法对于防控 PRRSV 具有重要意义。随着养猪业贸易国际化，养猪业正处于空前发展时期，亦使 得该病的防控难度增加。本研究自四川地区送检病料中分离出一株PRRSV NADC30- Like 毒株，对分离株进行部分生物学特性研究和生物信息学分析。同时建立了 NADC30-Like SYBR Green I qPCR 检测方法。并以分离株为基础，建立IPMA 和基于 重组N 蛋白间接ELISA 的两种抗体检测方法。本研究旨在了解分离株部分生物学特 性基础上，研究其重组演化与免疫的关系，进而完善PRRSV 检测方法，最终为准确 可靠诊断出NADC30-Like 毒株奠定基础，同时为更好地防控PRRSV 提供科学参考。 1. NADC30-Like PRRSV SYBR Green I qPCR 检测方法的建立与初步应用 为更加快捷准确的鉴别诊断出NADC30-Like PRRSV 病原，本研究建立了SYBR Green I qPCR 检测方法，设计该类毒株保守的特异性引物，制备其标准品，建立标准 曲线方程：Ct ＝－3.143 lg （copies ）＋ 43.032 ，拷贝数与Ct 值具有良好的线性关系， 2 2 R ＝0.975 ，扩增效率为 108.1% ，组内变异系数小于 1.6% ，灵敏度可达 8.85×10 copies/μL。该方法检测灵敏度、特异性较高，具有良好的应用价值。 2.毒株分离鉴定及其部分生物学特性与生物信息学分析 本研究对上述阳性样本进行筛查确保无其它病原，开展病毒分离工作，以上述方 法检测与IFA 进行鉴定，确定为PRRSV ，与常见的PRRSV 毒株相比，分离株在分 -4.17 离前期不产生明显CPE，后期出现CPE ，测定其滴度为10 TCID50/0.1 mL ；生物 信息学分析显示其为 PRRSV NADC30-Like 毒株，命名为 CJS01 株。通过对毒株在 Marc-145 细胞上增殖过程中核酸载量的测定，表明病毒在细胞上适应性良好，病毒在 细胞上增殖到84 h 核酸载量最高；通过对ORF3~7 基因的重组分析及其抗原表位预 测，发现 CJS01 株引起畜体产生中和抗体和亚中和抗体的两个重要核苷酸位点均在 此重组区间，可能致使免疫形势更为复杂。 3. PRRSV NADC30-like 毒株IPMA 方法的建立 由于NADC30-Like PRRSV 作为新型PRRSV 毒株，尚需对其产生抗体方面深入 研究。IPMA 检测方法在对抗体产生时间与种类等方面有诸多优势。本研究在分离株 CJS01 的基础上建立一种IPMA 检测方法，优化其初始细胞接种剂量、最佳孵育时间 I -4.17 与二抗浓度分别为病毒液 （10 TCID50/0.1mL ）接种量10 倍稀释； HRP-SPA 的二 抗按1 ∶3000 的倍数、血清以1 ∶30 的倍数进行稀释。结果表明该方法特异性高而敏 感性低，有应用于探索新毒株抗体产生相关研究的潜力。 4.基于重组N 蛋白间接ELISA 方法的建立与初步应用 为适应临床大量样本的检测，本研究通过构建PRRSV NADC30-Like 毒株N 基 因的重组蛋白质粒 pET32a-N ，通过 SDS电泳鉴定目标蛋白为可溶性蛋白； Western blotting 与间接ELISA 方法验证结果表明蛋白具有良好的反应原性；对表达 条件进行了一系列优化，表明在37 ℃，IPTG 终浓度为0.2 mmol/L 诱导表达2 h 为最 佳表达条件。以表达的重组N 蛋白为包被原，当其抗原包被的浓度为10 μg/mL，待 测血清以40 倍稀释、使用二抗稀释3000 倍时进行反应，此条件下效果理想，可较好 进行临