伪狂犬病毒IE180基因互补缺失系统的构建.pdfVIP

摘 要 伪狂犬病 （Pseudorabies,PR 或Aujeszky’sdisease,AD）是由伪狂犬病毒 （pseudorabiesvirus, PRV）感染引起的一种急性传染病。猪是伪狂犬病毒的唯一贮存宿主，该病毒的潜伏特性导致该 病的难以根除和净化。PRV 跟其他的甲型疱疹病毒基因组一样，按照严格的级联方式调节基因组 的表达，即在复制转录的生命周期中被分为立即早期基因、早期基因和晚期基因。值得我们关注 的是PRV 不同于其他甲型疱疹病毒，它仅有一个立即早期基因即IE180，且同单纯疱疹病毒 （HSV-1）的ICP4 基因同源。IE180 是PRV 基因组中第一个被转录表达的蛋白，其作为强有力 转录激活因子，对病毒基因组起始复制和早期转录是必需的。PRV 基因组中存在着两个IE180 基 因拷贝，早期研究证实将IE180 基因两个拷贝同时缺失而构建的重组克隆，这种重组克隆不感染 宿主也不感染细胞而彻底丧失感染能力，不能拯救出活病毒。此外，PRV 有着较为广泛的宿主谱， 并逐渐被病毒学家们用做一个研究疱疹病毒分子生物学的模式生物并在动物模型中被广泛应用 于神经追踪。 目前，PRVIE180 的生物学功能尚不完全明确，为进一步深入研究PRVIE180 的功能，我们 构建了IE180 启动子缺失的重组克隆。本研究在本实验室已有的PRV JS-2012 株感染性克隆 pBAC-JS2012 的基础上利用GALK 正筛选系统和卡那霉素标记基因构建了PRVIE180 双启动子 缺失克隆，为后续获得稳定的IE180 基因互补缺失系统提供便利的框架支持。而这种互补缺失系 统为寻找与IE180 基因在基因组调控上有密切关联的其他表达分子提供了相对稳定的操作平台。 1.IE180 多克隆抗体的制备。分析IE180 基因全长氨基酸序列，截取抗原表位较好的三段基 因序列克隆到pcold-TF 载体上构建重组原核表达质粒pcold-TF-IE180a、pcold-TF-IE180b 和 pcold-TF-IE180c，三种重组表达质粒经过诱导后IE180 蛋白均能表达。将纯化效果较好的重组蛋 白His-IE180b和His-IE180c免疫小鼠，分离血清，获得的IE180多克隆抗体均能用于IFA和Western blot 检测和分析。 2. 伪狂犬病毒IE180 基因启动子缺失克隆的构建。在本实验室已有的PRVJS-2012 感染性克 隆pBAC-JS2012 及突变筛选菌株SW102-PRVBAC 基础上，利用galk 正筛选和卡那霉素的筛选标 记基因，构建IE180 两个拷贝启动子均删除的缺失克隆。利用同源重组将galk 表达盒替换掉 IE180TATA-box 及左边 297bp 碱基和右边 172bp 碱基，经 PCR 鉴定和筛选获得阳性克隆 SW102-galk。通过Westonblot 分析，IE180 仍然存在表达。再利用卡那霉素标记基因的筛选将kna 标记基因替换掉另一个拷贝IE180TATA-box 及其左边 134bp 和右边309bp 碱基，经过PCR 鉴定、 RFLP 分析、Westernblot 分析以及转染后绿色荧光表达的分析，证实IE180 不再表达，本研究成 功筛选到IE180 启动子缺失的阳性克隆pPRV-DIE180-BAC。 3. 伪狂犬病毒IE180 缺失互补系统的构建。为了弥补pPRV-DIE180-BAC 中IE180 的缺陷表 达，本文利用IE180 基因全长中独有的酶切位点pvu Ⅰ将IE180 基因分段扩增，构建IE180 真核 表达质粒pCAGGS-IE180，其转染细胞后，Westernblot 结果显示，IE180 蛋白获得表达。该质粒 与IE180 缺失克隆pPRV-DIE180-BAC 共转染细胞时，pCAGGS-IE180 能弥补pPRV-DIE180-BAC 中IE180 基因的缺失，实现IE180 基因缺失后病毒粒子的复制。 I 关键词：伪狂犬病病毒，IE180，缺失克隆，互补，多克隆抗体 II Abstract Pseudorabies virus (PRV) is the causativ