胃肠道微生物宏基因组中耐盐酶类、基因及6-磷酸海藻糖水解酶的研究.pdfVIP

摘要 摘要 耐盐酶类及基因对于高盐环境中微生物的生长代谢具有重要作用，并在海 产品加工、洗涤等生物技术领域广泛应用。相对高渗的胃肠道腔（~0.3 mol/L NaCl ） 及饮食变化可导致动物胃肠道中渗透压的产生，因此胃肠道微生物中可能蕴藏 着丰富的耐盐酶类及基因资源。本文以倭蜂猴及大额牛胃肠道微生物为研究对 象，从已构建的宏基因组文库中筛选耐盐克隆并测序，分析潜在的耐盐酶类及 基因，并进一步对 6-磷酸海藻糖水解酶进行异源表达及鉴定，以挖掘胃肠道微 生物宏基因组中的耐盐酶类及基因，为探究胃肠道微生物的耐盐机理及该环境 中耐盐酶类和基因的开发利用奠定理论基础。研究结果总结如下： 1. 胃肠道微生物宏基因组文库中耐盐克隆的筛选、测序及分析 以7% NaCl (w/v) 为筛选因子，从倭蜂猴和大额牛胃肠道微生物宏基因组文 库中分别获得 4 个（1A、3-1、5_1_1、5_1_5 ）和6 个（21_9A 、24_7H 、16_2E、 16_2D、16_8H、、1_2G）耐盐性较强的克隆。对其进行高通量测序及生物信息 学分析，结果从耐盐克隆中共获得 1285 个基因及酶类， 其中 91 个为潜在的耐 盐基因及酶类。 2. 耐盐克隆基因的功能注释 GO 富集分析表明，大多数耐盐克隆基因都与生物过程（biological process ） 和分子功能（molecular function ）有关。基于COG 的功能分类表明，耐盐克隆 的基因主要涉及碳水化合物的输送和代谢（carbohydrate transport and metabolism ）、转录（transcription ）、复制、重组和修复（replication, recombination and repair ）、无机离子转运和代谢（inorganic ion transport and metabolism ）、防御 机制（defense mechanism ）和移动元件：原噬菌体，转座子（mobilome: prophages, transponsons ）。KEGG 代谢途径注释表明，耐盐克隆基因主要与碳水化合物代谢 （carbohydrate metabolism ）、膜转运（membrane transport ）、耐药性（drug resistance ） 和核苷酸代谢（nucleotide metabolism ）有关。 3. 6-磷酸海藻糖水解酶的异源表达、纯化及鉴定 对测序分析获得的 6-磷酸海藻糖水解酶进一步异源表达和纯化，获得两个 重组 6-磷酸海藻糖水解酶 rTRE_P2 和 rTRE_P3 。酶学性质研究结果表明， I 摘要 rTRE_P2 和 rTRE_P3 的最适反应 pH 为 7.5，最适反应温度为 30℃。两者均具 有良好的耐盐性，酶活性随 NaCl 浓度的增加而增强。在 0.5-5 mol/L NaCl 条件 下处理 1 h 或 24 h ，酶活性与 NaCl 浓度呈正相关，其中，rTRE_P2 在 5 mol/L NaCl 条件下处理 24 h ，酶活性提高约 43 倍 。两者活性均被 1mmol/L PbCl 、CTAB、 2 AgNO 、CuSO 、HgCl 和 ZnSO 完全抑制。重组 rTRE_P2 和 rTRE_P3 均能有 3 4 2 4 效分解对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG ）和6-磷酸海藻糖，以 pNPG 为底