分子生物学-12-3-第六章-芯片等其它分子生物学技术.docVIP

PAGE 郜刚分子生物学教案 第六章 基因功能研究技术 6.4 芯片等其它分子生物学技术 生物芯片 生物芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指利用机器人进行操作，通过缩微技术、微加工技术、光引导化学合成技术和微电子技术等，自动在硅片、玻璃片、凝胶或尼龙膜等物质制造的固体芯片表面上，将成千上万的具有生物活性的大分子（DNA等）制作成微阵列。 6.4.1生物芯片的一般类型 1. 按照芯片基质上固定的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为DNA或基因芯片、蛋白质芯片、RNA芯片、细胞芯片、组织芯片、芯片实验室(Lab on chip)。 如果芯片上固定的是肽或蛋白，则称为肽芯片或蛋白芯片； 如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或DNA，就是DNA芯片。 “芯片实验室”通过微细加工工艺制作的微滤器、微反应器、微泵、微阀门、微电极等以实现对生物样品从制备、生化反应到检测和分析的全过程，从而极大地缩短的检测和分析时间，节省了实验材料，相当于一个具有各种功能的芯片的集合体。 2. 按照生物芯片的制作技术，可以将生物芯片划分为微矩阵和原位合成芯片。 3. 根据生物化学反应过程，又可以将生物芯片进行另外一种分类：因为通常的生物化学反应过程包括三步：即样品的制备、生化反应、结果检测和分析。 所以我们可以根据这三个不同的步骤，把生物芯片分为不同的类型即用于样品制备的生物芯片，生化反应生物芯片及各种检测用生物芯片等。 4. 根据原理还有元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。 5. 另外一种分法即 靶片：将待测（靶）未知序列DNA固定于支持物上 探片：将大量已知序列分子固定于支持物上作为探针分析其他序列 基因芯片 基因芯片就是脱氧核糖核酸的微点阵，在极小的芯片上，成一定规则地排列着大量已知碱基序列的DNA片段。 将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。 根据碱基互补配对原则，确定。 这里有一点需要说明的是由于基因芯片（Genechip）这一专有名词已经被业界的这个龙头老大Affymetrix公司注册专利，因而其他厂家的同类产品通常称为DNA微阵列（DNA Microarray）。 基因芯片技术的主要特点 技术操作简单 自动化程高 序列数量大 检测效率高 应用范围广 成本? 基因芯片的制作技术 光引导原位聚合技术 压电打印原位聚合技术 点模型 基因芯片的主要应用 1 基因表达检测 拟南芥、酵母基因表达研究等 2 突变检测 BRCAⅠ基因外显子11]、CFTR基因、β-地中海贫血、酵母突变菌株、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等 3 基因组多态性分析 人类基因组单核苷酸多态性的鉴定及分型，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等 4 基因文库作图 通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图 基因芯片数据分析 不讲 6.5 利用酵母鉴定靶基因功能 不讲 6.6.1 凝胶滞缓实验 electrophoretic mobility shift assay,EMSA 又叫作DNA迁移率变动试验 （DNA mobility shift assay） 又叫做凝胶阻滞实验（Gel retardation assay）是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 1.凝胶滞缓实验 用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 分离纯化特定DNA结合蛋白的一种典型的实验方法。 凝胶阻滞实验原理 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA 朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 DNA与蛋白的结合导致了电泳迁移率的降低 6.6.2 噬菌体展示技术 丝状噬菌体 噬菌体展示技术的基本原理 将外源蛋白的基因克隆到噬菌体基因组中，与噬菌体外壳蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。 这些展示在噬菌体表面的融合蛋白进一步作为“诱饵”蛋白，直接用于捕获靶蛋白库中与之相互作用的蛋白质。 是一种非常有效的筛选技术 特点：噬菌体中的遗传基因型（外源DNA）和融合蛋白的表型就出现了一对一的的直接对应关系。 这正是噬菌体展示技术的优点，它有利于搞清楚DNA与蛋白质的对应关系。 其他表面展示系统 6.6.3 蛋白质磷酸化分析技术 由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷