分子医学技能：佐剂制备.pptVIP

佐剂制备 实验目的和要求 初次应答和再次应答抗体产生的规律； 影响机体免疫应答强度的因素。 制备牛血清白蛋白（BSA）的抗血清； 熟悉佐剂的制备和动物免疫的常用方法； 了解抗体检测常用方法。 在免疫学实验中,为制备抗体通常以抗原性物质给动物注射,经一定时间后,动物血清中可产生大量特异性抗体，这种含有特异性抗体的血清称免疫血清。 抗体的产生通常与抗原的质和量、动物种类以及接种途径有密切关系。 实验原理 实验方案 免疫佐剂制备及动物初次免疫 W1 W2 W3 初次免疫 再次免疫 实验材料 动物：昆明鼠（每组一只），约20g／只。 抗原：4mg／ml牛血清白蛋白（BSA) 佐剂：完全福氏佐剂。 其它： 无菌小试管，棉签，1ml注射器、12＃针头等。 1.5mlBSA 1.5ml完全 福氏佐剂 搅拌 完全乳化 实验步骤 1.抗原制备 滴于水中经久不散 2.动物免疫 用1ml注射器12＃针头吸出完全乳化的抗原1ml； 换4＃针头双后足垫和背部皮下接种，每处约10-20μl。(接种处先用碘酒、酒精消毒) 免疫后的小鼠断颈处死。 实验步骤 注意: 搅拌时间约为15分钟 老鼠断颈椎处死后放到楼梯口的红桶 切勿将搅拌针弄坏 Thanks! 免疫佐剂(Adjuvents) 简称佐剂，是一种能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答、增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而自身并无免疫原性，不能引起免疫应答反应的物质。 佐剂具有以下几条标准 ①无致癌性 ②无毒性 ③纯度高 ④有一定的吸附力 ⑤在动物体内能被降解吸收 ⑥不含与动物有交叉反应的抗原物质 ⑦不应诱发自身超敏反应 ⑧稳定，储存1 年以上不分解、不变质。 佐剂的分类 Cox等将佐剂分成两个大类:特异性与非特异性佐剂。 Singh等将佐剂分成 具有抗原载体功能的佐剂,例如乳剂、ISCOM (免疫刺激复合物)和脂质体等; 具有免疫激活作用的佐剂,例如脂多糖(LPS) 、胞壁酰二肽(MDP)和CpG寡聚脱氧核苷酸等。 佐剂的分类 Audibert和Lise依据佐剂来源,将佐剂分成四类: ①来源于植物的佐剂,例如皂甙和多糖类提取物等; ②来源于病原微生物的佐剂,例如MDP、单磷脂A、霍乱毒素以及CpG寡聚脱氧核苷酸等; ③化学合成佐剂,例如铝化合物、复合多聚物、丙交酯、乙交酯等; ④细胞因子和激素类佐剂,例如IL-2、GM-CSF以及去氢表雄酮等。 Edelman对佐剂的分类 ①表面活性物质及其微粒类,例如ISCOM、Ty类病毒颗粒等; ②细菌或病毒产物,例如肺炎克雷伯杆菌糖蛋白、海藻糖结核环脂酸盐等,以及具有载体功能的白喉类毒素、B型脑膜炎球菌外膜蛋白等; ③细胞因子,例如α或γ-干扰素、GM-CSF、IL-1、IL-2等; ④激素,例如1, 25-二羟维生素D3、人生长激素等; ⑤独特抗原架构,例如N-端软脂酰化CTL抗原决定簇与Th细胞抗原决定簇的结合物等; ⑥多阴离子物质,例如右旋糖苷; ⑦多聚丙烯酸衍生物,例如丙烯酸与烯丙基蔗糖交联物等; ⑧活病原微生物,例如啤酒酵母、减毒伤寒杆菌、戈登氏链球菌等; ⑨佐剂制剂,例如弗氏不完全佐剂、MF-59、脂质体等;  ⑩其它,例如CGP-11637、硬脂酰酪氨酸等。 佐剂作用机理和方式 在注射部位形成抗原储池,可以延缓抗原释放速率,延长免疫反应,提高免疫记忆细胞数量。 例如,矿物胶体、乳剂类佐剂等 有些佐剂具有载体功能,可以改变抗原的物理状态以及它们与免疫系统的作用方式。 例如ISCOMS、脂质体等 具有直接或间接药理作用的佐剂,可以改变参与免疫反应的多种细胞的功能。 佐剂改变参与免疫反应 激活免疫细胞,尤其是巨噬细胞等APC,刺激巨噬细胞产生IL-1，提高免疫细胞的局部浓度，提高APC的抗原递呈功能 通过直接作用于T细胞而发挥作用 活化B细胞，例如LPS可以调节B 细胞表面Ig受体 很多佐剂具有(旁路)激活补体的作用，例如菊粉、左旋咪唑和酵母多糖等，有助于抗原与APC通过补体受体相结合 某些佐剂还可能具有潜在诱导细胞毒作用 小分子西弗氏碱类化合物作为佐剂，能够替代通常存在于抗原递呈细胞表面的羧基生理性供体，进而与T细胞表面受体中的胺类相互作用，为T细胞提供辅助刺激信号,并激活细胞膜表面的Na+ -K+ ATP酶，使关键信号传导蛋白磷酸化。 佐剂调控细胞因子 佐剂的作用机理-增强或调节针对疫苗抗原的免疫应答: ①提高弱抗原的免疫原性 ②提高免疫应答出现的速度和延长免疫应答的持续期 ③集中产生保护性免疫应答 ④调节抗体亲和性、特异性、同种型或亚类转换以及分布 ⑤激活细胞毒T 淋巴细胞( CTLs) ⑥促进粘膜免疫的诱导 ⑦强化免疫学不成熟个体或者免疫