分子生物学-10-4-第五章 RNA提取.docVIP

PAGE 郜刚分子生物学教案 教学内容与教学设计： 5.3.1 由于RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子，如mRNA,它携带了DNA的全部编码信息 要了解生物某个器官或结构的功能和作用机理，一个重要的方式就是从分子角度去研究其功能基因的表达和调控，而分离得到高质量的RNA是进一步研究进行的首要条件,比如从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。要进行Northern杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库，RT-PCR及差示分析等分子生物学研究，都需要高质量的RNA。因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在。　RNA的制备与分析对于了解基因表达在转录水平上的调节是必不可少的,也是最常使用的通过cDNA途径分析细胞基因表达的前提。 植物细胞内的RNA主要是 rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和 mRNA（占1～5％）。rRNA含量最丰富，由25S、18S和5S几类组成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数mRNA在3’ 通常一个典型的哺乳动物细胞约含10-5μg RNA，但其中大部分为rRNA及tRNA，而mRNA仅占1%～5%。虽然mRNA大小和序列各不相同，但在多数真核细胞mRNA的3’ 最常用的方法主要有:原位杂交、RT-PCR、Northern ,另外还有: Sl 核酸酶作图分析、引物延伸法等 在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。 在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其他分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。 各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。 防止RNA酶的污染 1.如果可能，实验室应专门辟出RNA操作区，离心机，移液器，试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期行除菌。 2.如果可能，在超净台中按照细胞培养的要求进行操作，可以有效避免操作中引起的RNA酶污染。 3.操作过程中应始终戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染用具，尽避免使用一次性塑料手套。塑料手套不但常常造成操作不便，且塑料手套的多出部分常常在器具的RNase污染处和RNase-free处传递RNase，扩大污染。 4.避免在操作中说话聊天。也可以戴口罩以防止引起RNA酶污染。 5.尽量使用一次性的塑料制品，尽量避免共用器具如滤纸，tips，tubes等，以防交叉污染。例如，从事RNA探针工作的研究者经常使用RNase H，T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、离心机等的污染。而这些污染了的器具是RNA操作的大敌。 6. 关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等。多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNA酶污染，买来后可直接用于RNA操作。许多研究者用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNA酶，从而导致实验失败。 7.配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶。 8.所有旧塑料制品都必须用0.5M的NaOH处理10分钟，用双蒸水彻底冲洗，DEPC-H20浸泡过夜后灭菌。 9.无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA酶的活性。但氯仿会溶解某些塑料制品，应当注意。 如用180℃干烤8小时以上处理玻璃器皿，或用0.1?的焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相关的缓冲液也需要用0.1? DEPC水处理，但Tris-Cl缓冲液等不可以用DEPC 注意：DEPC有致癌之嫌 ，必须小心操作，防止接触与吸入 ！ RNA酶抑制剂 1、 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 DEPC即diethypyrocarbonate，中文名为焦碳酸二乙酯。分子式为C6H10O5，分子量为162.14 2、 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也