分子生物学-12-2-其他技术.pptVIP

6.6 其它分子生物学技术 6.6.1 凝胶滞缓实验 electrophoretic mobility shift assay,EMSA 又叫作DNA迁移率变动试验 （DNA mobility shift assay） 又叫做凝胶阻滞实验（Gel retardation assay）是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 1.凝胶滞缓实验 是在1980年代初期出现 用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 它具有简单、快捷等优点， 也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白的一种典型的实验方法。 凝胶阻滞实验原理 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA 朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 DNA与蛋白的结合导致了电泳迁移率的降低 凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于同一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带 A C B 放射自显影 * * * * 凝胶电泳 放射性标记的DNA 细胞蛋白质提取物 蛋白质与DNA结合 * * * * * * DNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢 滞后带：表明DNA与蛋白质结合 B B 凝胶阻滞实验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定DNA片断结合的蛋白质分子 而且可以较为精确地研究DNA序列的特异性。（加入超量的非标记竞争DNA） 这里？ 特异性结合？ 在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用，可以同时鉴定不同的DNA与不同的蛋白质之间的相互作用； 或者鉴定同一个DNA更容易与那种蛋白质结合 (a) (b) (c) （a）没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（b）加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；（c）竞争DNA与探针DNA分别结合不同的蛋白质，出现同（a）类似的阻滞条带。 * 蛋白质A与未标记的竞争DNA结合 凝胶电泳 放射自显影 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * p224 多余出来的探针DNA 蛋白质A和B 蛋白质A 蛋白质A 蛋白质A与标记的探针DNA结合 * * * * * * 可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。 1. 用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测某种蛋白是否属于此类转录因子 2. 在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。 插播内容 6.6.2 噬菌体展示技术 分子生物学讲义 山西师范大学生命科学学院 噬菌体的类型 细菌病毒的总称，英文为 Bacteriophage， 来源于希腊文“phagos”， 有“吞噬”之意。 溶菌周期，烈性噬菌体，裂解宿主细胞，产生出大量的子代噬菌体。 溶源周期，温和噬菌体，噬菌体DNA整合到宿主细胞染色体DNA上，不产生子代噬菌体。 丝状噬菌体 噬菌体展示技术的基本原理 将外源蛋白的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外壳蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。 这些展示在噬菌体表面的融合蛋白进一步作为“诱饵”蛋白，直接用于捕获靶蛋白库中与之相互作用的蛋白质。 是一种非常有效的筛选技术 Fusion protein PIII phenotype genotype 外源 外壳 特点：噬菌体中的遗传基因型（外源DNA）和融合蛋白的表型就出现了一对一的的直接对应关系。 这正是噬菌体展示技术的优点，它有利于搞清楚DNA与蛋白质的对应关系。 噬菌体展示也是一种基因克隆新策略？ 基于生物大分子间相互作用的cDNA克隆策略 噬菌体展示法与功能结合法的联合应用，可筛选获得具有与目的蛋白高度亲和力的未知蛋白的编码基因cDNA 因为：生物大分子的生物学效应是通过与其他大分子结合并相互作用而产生的，因此，以一已知蛋白为“诱耳”就能“钓”出与其相互作用的另一未知蛋白，并进而克隆其相应的cDNA。 补充 噬菌体展示法（融合表达）与功能结合法(蛋白互作)的联合应用，可筛选获得具有与目的蛋白高度亲和力的未知蛋白的编码基因cDNA 启动子 外壳蛋白 将要筛选的 未知cDNA 文库 噬菌体载体 融合基因转化E.coli 产生融合噬菌体 融合蛋白 与目的 蛋白互作 洗脱后，重新感染E.coli 互作，结合 不互作，不结合 确定出基因 噬菌体展示 （融合表达） 功能结合 （蛋白互作） 补充 其他表面展示系统 表面展示系统