高级病理学：免疫组化技术原理与应用.pptVIP

　免疫组化技术原理与应用 一、免疫组化技术的基本原理 　（一）荧光抗体染色方法 　　　　 　　直接法　　　　　　间接法 直接法简单、特异性高，应用范围窄，敏感性不如间接法 需要荧光显微镜观察 切片不能长期保存 （二）酶标记抗体染色法 　　　直接法　　　　间接法 辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体 HRP催化H2O2分解，使联苯胺 （DAB）氧化为联苯亚胺，呈棕色反应 直接法很少用，用于单抗筛选 在上述酶标记过程中，酶与抗体之间结合损害部分抗体和酶的活化，降低了抗体的效价 另外，血清中非特异性抗体也可以被酶标记，在染色中增加了非特异性背景染色 （三）抗酶抗体法（非标记抗体法） （三）抗酶抗体法（非标记抗体法） PAP法：Peroxidase-antiperoxidase 首先，用酶（HRP ）免疫动物，制备成高效价、特异性强的抗酶抗体。 而后，将３个酶分子和２个抗酶抗体结合形成环型结构的PAP复合物。 Ab HRP PAP复合物 　基本流程 优点：敏感性高；背景染色低 特异性抗体 二抗 PAP复合物 HRP使DAB显示棕色 （四）亲和免疫组织化学技术 前者为亲和物质间的作用；后者是抗体抗原的免疫反应，也可被认为广义的亲和反应。 常用的亲和物质： 　①植物凝集素与糖 ②葡萄球菌A蛋白与IgG ③生物素Biotin与卵白素Avidin ④受体与配体 ⑤阴阳离子 ABC法(Avidin biotin-peroxidase complex) 染色原理与流程： ABC：①Biotin+HRP Biotin-HRP 　　　 ②1分子Avidin+3分子Biotin-HRP 特异性抗体 生物素化二抗 （可结合4个ABC复合物） ABC复合物 HRP使DAB显示棕色 优点：①敏感性高，ABC法比PAP法敏感20－40倍 　　　②特异性强，背景染色显著减轻 　　　③稳定性好，ABC试剂盒可于4°C保存２年 　　　　　　　　　　　ABC法染色步骤： 1，石蜡切片脱蜡至水 2，0.01mol/L，PH7.2PBS洗3次，3min 3，0.1%-0.05%胰蛋白酶消化10-30min，37°C 或4%胃蛋白酶消化30-60min，37°C 4，PBS 3X3min 5，0.3%H2O2甲醇液，室温10-30min 6，5%-10%正常血清，室温20 min 7，不洗，滴加适当浓度的特异性抗体， 如1：100的McAbDesmin，37°C60min，或4°C过夜 8，PBS 3X3min 9，生物素化羊抗鼠二抗，1：200，37°C，40min 10，PBS 3X3min 11，ABC1：100-1：150，37°C，40-50min （A和B液等量于用前混合） 12，PBS 3X3min 13，0.04%DAB+0.03%H2O2显色5-12min，充分水洗 14，苏木素复染30 s，盐水酒精分化，常规封片 二、免疫组化技术在肿瘤研究和鉴别诊断上的应用 　至今，具有诊断价值的标记物已超过 １００多种。其种类可分为以下几种： １、与肿瘤组织细胞发生有关的有： ①组织特异性抗原 ②细胞特异性抗原 ③中间丝蛋白 ④血型物质 ⑤凝集素 ２、与肿瘤生长相关的抗原 ①肿瘤胚胎抗原 ②肿瘤相关抗原 ③细胞机能抗原 ④某些酶与激素 ⑤病毒基因 其中，在肿瘤鉴别诊断中，具有代表性的是５种中间丝蛋白： 　①上皮细胞的角蛋白（Keratin） 　②间胚叶细胞的波纹蛋白（Vimentin） 　③肌细胞的结蛋白（Desmin） 　④神经元的神经细丝 　⑤神经胶质细胞的胶质细丝酸性蛋白 （Glial fibrillary acide protein） 淋巴、造血系统识别Ｂ和Ｔ细胞表型抗原的单克隆抗体（如ＣＤ类） （一）上皮性肿瘤标记物 １、角蛋白 仅见于各个胚层向上皮细胞分化的胞浆内 多用于鉴别上皮性和非上皮性 现认为几乎所有上皮细胞都含有角蛋白 例外：晶状体上皮和肾小球足突上皮细胞阴性；滑膜细胞阳性。 其含量与肿瘤的分化程度有关 ２、上皮膜抗原（EMA） 上皮膜抗原是人乳腺上皮细胞分泌产物，为人乳脂小球组分之一，是一组糖蛋白，具有酶的活性 广泛存在于各种上皮细胞膜系结构中 其分布范围与Keratin相似 对内脏的腺上皮优于Keratin 一些分化较差的腺癌EMA亦可呈强阳性反应 因此，在上皮源性肿瘤鉴别诊断时，最好是Keratin 和EMA合用 ３、前列腺特异抗原（Prostate specific antigen,PSA） 是前列腺上皮细胞所特有的一种糖蛋白 存在于正常及增生的前列腺上皮细胞，