基因工程：第二章 DNA重组克隆的操作单元 (3).pptVIP

步骤： 1. 将从大肠杆菌菌落或噬菌体群体中制备的带有目的基因 的重组质粒DNA变性后，与总mRNA杂交； 2. 转入无细胞转译体系（麦胚提取物或兔网织红细胞提取物）,由于加有35S标记的蛋氨酸，转译的多肽蛋白质可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析； 3. 结果同未杂交的mRNA转译产物作比较，从中找出其转译合成被抑制的mRNA，即同目的基因变性DNA互补彼此杂交的mRNA。 3. 外源基因产物检测 3.1 蛋白质生物功能测定法 杂交释放转译鉴定： 合并 变性 挂柱 制备 上样 淋洗 洗 脱 翻 译 测 活 重组DNA 单链DNA mRNA 杂交的mDNA 蛋白质 蛋白质 无细胞体外翻译系统：麦胚提取物、网织红细胞提取物 3. 外源基因产物检测 3.1 蛋白质生物功能测定法 3.2 蛋白质生物结构鉴定法 放射免疫原位杂交鉴定： 影印 用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印 洗涤 与I125标记的IgG保温 感光 轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定 与I125标记的IgG保温 洗涤、干燥、感光 用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板 含抗体的聚乙烯膜 裂解平板 3. 外源基因产物检测 3.2 蛋白质生物结构鉴定法 免疫沉淀鉴定： 在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体 然后涂布转化液 37℃ 培养 经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标 蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀 反应，在菌落周围形成白色的圆斑 此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大 3. 外源基因产物检测 3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选 如果克隆在载体质粒上外源基因高效表达，会出现比较宽的考马斯亮蓝染色带 3. 外源基因产物检测 * The Top 10 list includes, in rank order, (1) Magnaporthe oryzae; (2) Botrytis cinerea; (3) Puccinia spp.; (4) Fusarium graminearum; (5) Fusarium oxysporum; (6) Blumeria graminis; (7) Mycosphaerella graminicola; (8) Colletotrichum spp.; (9) Ustilago maydis; (10) Melampsora lini 含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）不能在含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补。 TK-细胞因氨基喋呤抑制了dTTP的合成而死亡，TK+细胞可存活，以此进行筛选。 1. 载体遗传标记检测 1.2 营养缺陷型筛选法 常见的营养缺陷型筛选标记： dCDP dTDP dTTP AP AP 氨基喋呤 1. 载体遗传标记检测 1.3 显色筛选法 显色筛选法的基本原理： 显色筛选法可以区分转化子与非转化子（依靠抗生素等其它筛选标记），也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。 1. 载体遗传标记检测 1.3 显色筛选法 显色筛选法的基本操作： pUC18 Ap r lacZ ori Ap + X-gal 重组子（Apr + lacZ-） 将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落 1. 载体遗传标记检测 1.4 致死性筛选 2.1 PCR法 2. 克隆DNA序列检测 2. 克隆DNA序列检测 2.2 限制性酶切图谱法 所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。 但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。 2. 克隆DNA序列检测 2.2 限制性酶切图谱法 全酶解图谱法： pUC18 2.7 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P 4.0 kb 1.0 kb 0.8 kb 区分重组子与非重组子 用BamHI酶切