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EPO 工程细胞大规模 培养方法和反应器 马佳鹏 刘丽佳 70 期生命科学与技术基地班 沈阳药科大学 2 红细胞生成素 (erythropoietin,EPO) 红细胞生成素 (erythropoietin,EPO) 是一种糖蛋白 , 它是红细胞发育成熟过 程中的一种最重要的调节因子 , 它在治 疗肾衰引起的贫血中 , 显示明显的疗效 和很小的副作用 ; 在纠正恶性肿瘤相关 贫血、艾滋病引起的贫血和化疗引起 的贫血等方面 , 也显示乐观的前景 ; 还 可在手术前作为自体输血 , 从而避免感 染血源性疾病等等。因此 EPO 是很有 前途的一种细胞因子 3 rhEPO 的工程细胞 rhEPO ( 人重组红细胞生成素 ) 的 工程细胞通常使用 CHO 细胞 , 因为 CHO 细胞是重组糖蛋白生产的首选体系 , 而 rhEPO 就是一种糖蛋白 .CHO 细胞是体 壁依赖性细胞 . 4 培养基 微载体 生物反应器 rhEPO rhEPO 工程细胞 CHO 培养参数 分泌产物 分离纯化 5 培养基 ? 天然培养基 ? 合成培养基 ? 无血清培养基 6 无血清培养基 无血清培养基是在合成培养基内加 入不同种类的补充因子而替代 PBS 的培 养基 . 它避免了血清培养基污染的可能性 , 并排除了批次间的差别还减少了纯化的 难度 . 但无血清培养基没有广泛的适应 性 , 不同的细胞甚至不同的细胞株和细 胞系有各自独立的无血型培养基配方 . 7 ? 补充因子 是无血清培养基中各种血清替代成 分的总称。补充因子的种类繁多 , 主要有生物 大分子、小分子和微量元素等。补充因子又 可归类为 必需补充因子 和 特殊补充因子 。 ? 必需补充 因子 : 胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠 所有的细胞株在无血清培养基中生长时都需 要的 , ? 特殊补充 因子 : ①生长因子②激素③贴壁因子 ④其它补充因子 8 ? 1. 胰岛素 : 细胞无血清培养中 , 胰岛素的 使用浓度为 0.1~10μg·mL -1 。胰岛素可 以促进 RNA 、蛋白质和脂肪酸的合成 , 抑制细胞凋亡 , 是重要的细胞存活因子 , 部分学者认为在批式培养中胰岛素迅速 耗尽是细胞比生长速率下降的主要原因。 ? CHO 细胞能在仅含重组人胰岛素一种蛋 白成分的无血清培养基中连续传代 9 2. 转铁蛋白 : 大多数哺乳动物细胞上存在特定的 转铁蛋白受体 , 受体与转铁蛋白 /Fe3+ 复合物 结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来 源 , 此外转铁蛋白还具有生长因子的性质并能 与其他微量元素如钒等结合。转铁蛋白的使 用浓度为 0.5~100μg·mL -1, 亦有研究报告指出 , 无血清培养基中必须要有转铁蛋白至少 5μg·mL -1, 胰岛素才能起作用。也有资料证实 转铁蛋白在无血清培养基中的作用可以为某 些铁盐所代替 , 如柠檬酸铁、二甲胂酸铁、葡 糖酸铁等。 10 3. 亚硒酸钠 :Hewlett 在 1991 年曾指出硒在 任何一种细胞 , 特别是人体细胞的生长 过程中确实具有明显作用 , 微量元素硒 参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧 化酶的作用过程 , 消除氧化物酶和氧自 由基对细胞的伤害。亚硒酸钠的最适添 加浓度是 30~60nmol· L-1 。 11 生产 rhEPO 的无血清培养基 ? 用于基因重组促人红细胞生成素 (Recombinant human erythropoietin, rHuEPO) 生产且不含牛血清白蛋白的无 血清培养基 -p (Serum free medium-p, SFM-p) 培养液 , 就是在达尔贝可改良的 伊格尔 (Dulbecco s modified Eagle s medium, DMEM) ∶ F12 (1 ∶ 1) 培养基中 添加了 Se 、乙醇胺、多种维生素、蛋白 胨、胰岛素、转铁蛋白和一些细胞因子 等成分构成的专用培养基 12 使用无血清培养基的问题 无血清培养基虽然在各个方面都显示出其 强大的优势和发展前景 , 但采用无血清培养而 诱发的细胞凋亡也成为动物细胞无血清培养 技术中亟待解决的问题 . 在培养基中加入某些 化合物 , 如金精三羧酸 (Aurint ricarboxylic acid, ATA) 、锌离子、抗氧化剂和细胞因子 等 , 在一定程度上可阻止因采用无血清培养 基而导致的细胞凋亡 . 13 无血清培养基展望 培养基中所添加的蛋白成分主要还是 来源于动物或人 , 仍然存在病毒污染的 危险 , 只有完全采用非动物来源的材料 , 才是相对安全的 , 而 植物提取物 将是理 想的选择 . 可以这样预测 , 未来开发的新 一代无血清培养基 , 将是一种既无血清、 无蛋白 , 又可以高温消毒 , 且适合于多种 不同细胞生长的