(完整版)细胞实验技术.docVIP

（一）干扰引物（ shRNA）设计： 1、NCBI 上下载基因序列 2、在 sigema 网站输入基因号设计一对 21 个碱基的干扰引物（上下游） 3、从起始密码（ ATG）下游 25bp 开始； 4、GC 含量介于 40%~60% 5、干扰引物至少一个在 SDS区，一个在 3’ UTR区 6、选择脱靶率低的 （二）、干扰载体构建 1、引物退火（引物加水看标签 X 50,弹匀，瞬离） 退火体系： 上游： 5ul 下游： 5ul 10X M buffer 5ul 2 35ul H O 水浴锅 100℃ 2min ，锅里隔夜 （三）、酶切 plko.1 载体 1、 AgeI 酶切，反应体系： plko.1 载体 4ug AgeI 2ul 10X AgeI buffer 5ul H2 O 39ul 37℃水浴 2~3h 2、切胶回收 AgeI 酶切产物， 30ul 水洗脱 3、 EcoRI酶切，反应体系： AgeI 酶切产物 30ul EcoRI 2ul 10X H buffer 5ul H2 O 13ul 37℃水浴 2~3h 切胶回收， 30ul 水洗脱，测浓度 （四）、连接 连接体系： T4 连接： 退火引物 2ul 退火引物 5ul 酶切载体 1ul 酶切载体 1ul Solution I 5ul T4 连接酶 1ul H2O 2ul T4 连接酶 Buffer 1ul H2O 2ul 室温下连接 4h。 （五）、转化 -80℃取感受态细胞于冰上融化，在 1.5ml 离心管加 33ul 感受态，将连接产物加入，冰上放置 30min ， 42℃ 水浴 60~90s，冰上放置 2min ，加入无氨苄培养基， 37℃摇床 1h，涂布在氨苄平板上， 37℃， 16h。 （六）、挑菌 用枪头挑取 5 个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基， 37℃过夜培养。 （七）、提质粒 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法，碱变性抽提质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。 在 pH 值高达 12.6 的碱性条件下， 染色体 DNA 的氢键断裂， 双螺旋结构 解开而变性。质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以 pH4.8 的 NaAc/KAc 高盐缓冲液去调节其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染 色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质－ SDS复 合物等一起沉淀下来而被除去。 简明原理： 碱裂解法是基于 DNA 的变性与复性差异而达到分离目的的。 碱性使质粒 DNA 变性，再将 pH 值调至 中性使其复性，复性的为质粒 DNA，而染色体 DNA 不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。 1、取 5ml 菌液于离心管， 12000 rpm 1min ，弃上清 2、向沉淀加 500 ul P1 ，震荡重悬 3、加入 500 ul P2 ，温和翻转 6~8 次，充分裂解 （不超过 5 min，一般 3min ） 4、加入 700 ul P3 ，温和翻转 6~8 次， 出现白色絮状沉淀， 12000 rpm 10 min 5、将上清加入 CS柱（已放入收集管）， 12000 rpm 2min ，将收集管中液体加入吸附柱 CP4中， 12000 rpm ， 1min ，弃废液 6、 CP4柱中加入 500 ul PD ,12000rpm ， 1 min ，弃液 7、 CP4柱中加入 600 ul Pw,室温放置 3 min ,12000rpm ， 1 min ，弃液 8、空离 12000rpm ， 2 min ，室温放置几分钟（把乙醇蒸发） 9、 CP4柱置于 1.5ml 离心管，向柱中心加 35 ul ddH 2O ，室温放置 2 min  ， 12000rpm  ，1 min 。 （八）、测质粒浓度 打开软件， ddH2O 清洗仪器 3~5 次，点击 black 每个样品吸取 1ul，于仪器上， F1，结果浓度大于 质粒置于 -20 ℃，保存  ， F1，结果不大于 0.2 500， OD 值 1.88~1.90 （九）、细胞复苏 1、 37℃预热  PBS， 取  8ml PBS  于  10 ml  离心管中 2、液氮中取出冻存的细胞， 37℃水浴融化 3、吸取冻存细胞于 PBS中，轻混匀，室温 800 rpm 3min ，去上清，加入 4、细胞重悬液加到 含 8ml 培养基的培养皿中， 37℃， 5% CO2 ,培养  1ml  培养基重悬， （十）、细胞分盘 1、吸去培