免疫组织化学与组织学相关技术课件（研究生）第一章 组织学研究方法在生物医学.pptVIP

四. 组织化学（histochemistry） 细胞化学（cytochemistry） 用于观察某些化学成分在组织和细胞内的定性、定位和定量信息。 1.糖类显色法 2.酶类显色法 3.核酸显色法 4.脂类显色法 PAS反应：过碘酸—希夫反应 (periodic acid Schiff reaction，PAS)： 检测组织或细胞中有无多糖存在。 基本原理： 多糖 PA 氧化 醛 Schiff 试剂 紫红色沉淀 PAS反应阳性部位即表示多糖和蛋白多糖的存在 1. 糖类显示法 PAS反应 2. 酶类显示法 通过显示酶的活性来表明酶的存在。 酶 底物 终产物（显色反应） G-6-P酶（葡萄糖-6-磷酸酶） 酶组织化学 3. 脂类显示法 标本可用甲醛固定、冷冻切片 用油红O、苏丹Ⅲ等脂溶性染料染色； 或用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。 ? 4. 核酸显示法 显示核酸的传统方法为Feulgen反应。 Feulgen反应过程： 切片经稀盐酸和Schiff试剂处理后，DNA存在处形成紫红色反应产物。 4. 核酸显示法 甲基绿-派洛宁反应 可同时显示细胞内的DNA和RNA，甲基绿与细胞内的DNA结合呈蓝绿色，派洛宁与核仁结合呈红色。 （三）火棉胶切片 常用于较大，精细或较坚硬的组织 （眼球、脑、脱钙骨）。 火棉胶切片机 （四）冰冻切片(frozen section) 优点： 快速，可更好地保存蛋白质或酶（抗原）的活性。 冰冻切片机 临床－术中快速病理诊断 科研： （五）苏木精-伊红染色 (H-E染色) 嗜碱性（basophilia） 苏木精呈碱性，可使胞核内的染色质及胞质内核糖体等染成蓝紫色。 ? 嗜酸性（acidophilia） 伊红呈酸性，可使多数细胞的胞质染成粉红色。 中性（neutrophilia） H-E染色常见用途 临床： 病理诊断 （金标准） 科研： 常用于动物实验中，比较不同处理对动物器官组织结构的影响。 病理诊断报告 病理诊断： 食管中低分化鳞状细胞癌侵入食管全层伴 食管旁淋巴结（1/3枚）,胃左动脉旁淋巴结 （1/1枚），腹膜后淋巴结（1/1枚）转移。… H-E Gross 其它染色方法（特殊染色法） Masson三色染色法（显示胶原） 银染法（显示神经元） 二、几种特殊显微镜的应用 （一）倒置相差显微镜 用途：用于观察培养 中活细胞的形态结构。 倒置相差显微镜图片 （二）荧光显微镜(fluorescence microscope) 构成: 光源----高压汞灯，可产生短波的紫外光。 普通光源 ?滤片系统— 显微镜： ? 荧光显微镜的应用： 1）观察组织细胞的自发性荧光 2）荧光染色后观察 荧光染料： 如：DAPI， Hoechst33342用于染细胞核（DNA） 罗丹明 GFP（绿色荧光蛋白） Hoechst33342核染色 Control AG490 3）免疫荧光染色法 应用荧光素标记抗体，在荧光显微镜下观察相对应的抗原的分布。 免疫荧光细胞化学（卫星细胞） DAPI + 罗丹明标记的抗E-cadherin一抗 PLoS Pathog.?2017 Sep 19;13(9):e1006609: 三标法（自噬蛋白） （三）共聚焦激光扫描显微镜(confocal  laser scanning microscope, CLSM) 特点： ①光源----激光； ②共聚焦成像扫描系统 ③电子光学系统； ④微机图象分析系统 ? CLSM应用： 可重建细胞的三维图像，可对细胞进行定量分析研究；故CLSM又有细胞CT之称。 体外培养大鼠附睾管上皮细胞Actin 免疫荧光染色, CLSM图象 三、 电子显微镜技术 (一) 透射电子显微镜 （transmission electron microscope, TEM） 透射电镜 ：发射的电子束透过样品所产生的物象投射到荧光屏上成像 用于观察亚细胞结构 细胞凋亡、自噬等研究 电子密度高（electron dense） 电子密度低 (electron lucent) R