(完整版)生物化学与分子生物学技术重点试题归纳.docxVIP

1、 说出三种蛋白质的测定方法，若你选择，你会选择哪一种？为什么？ 答：双缩脲法、 lowry 改良法、考马斯亮蓝（ Bradford ）法、 BCA （二喹啉甲酸）法、紫外 线分光光度法。我会选择 BCA 法。双缩脲法灵敏度差，特异性不高。 Lowry 改良法对样品 的溶解度要求高、易受物质干扰且容易产生测量误差。紫外线分光光度法的精确度差。而 BCA 法则能较好地弥补以上方法的缺点。它具有操作便捷快捷、精确度高、抗干扰能力强、能使用于微板孔等特点。 2、 western blot 印记中封闭液的作用？ 答：封闭液可以结合非相关蛋白的位点以降低非特异性结合的背景。 3、 γ球蛋白的提取过程。 答：（ 1）盐析 — 中性盐沉淀： 通过加入半包和硫酸铵可以使球蛋白沉淀， 品。  清蛋白留在溶液中。 得到γ球蛋白粗制 （ 2）脱盐 — 凝胶柱层析： 经过凝胶柱层析，使得大分子的蛋白质和小分子的盐分离。 （ 3）纯化 — DEAE 纤维素阴离子交换层析 用阴离子交换层析可以把在 PH=6.3 的缓冲液中的带负电的α、β球蛋白和带正电 的γ球蛋白分离。使γ球蛋白被洗脱出来被纯化。 （ 4）经过浓缩得到浓度高的γ球蛋白 4、离子交换剂的原理 答：离子交换剂是一种在高分子的不溶性载体上结合有若干活性基团，离的离子并和溶液中的其他离子进行交换。  这些活性基团含可解 5、 如果  western blot  中出现两条带，是否说明有杂质？为什么？ 答：并不说明有杂质。因为在实验中我们的检测对象是人血清 IgG ，IgG 是由两条轻链和两 条重链通过二硫键结合起来，变形后轻、重链分开，形成两条带（ 21KD 、 57KD ） 6、 分别简述 DNA 提取中蛋白酶 K 、 SDS、无水乙醇、 RNase 的作用 答：蛋白酶  K ：将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使  DNA  分子完整地分离出来。 SDS：破坏细胞的细胞膜、核膜并使组织蛋白和 无水乙醇：可以使 DNA 沉淀  DNA  分子分离 RNase：可以去除溶液中的  RNA （ EDTA ：抑制细胞中的  DNase  活性） 7、 试述转化质粒蓝白筛选的原理。 答：载体质粒 DNA 带有 -半乳糖苷酶 N 端 146 个氨基酸残基 （α片段）的编码信息， 经过 改造的宿主菌含有 -半乳糖苷酶 C 端（ ω 片段）的序列。只有当两个片段都存在的时候才 能形成有活性的 -半乳糖苷酶（这种现象称为α -互补）。 -半乳糖苷酶在 IPTG 的存在下可 以使底物 X-gal 转变为蓝色产物，使菌落变为蓝色。当外源 DNA 片段插入载体的多克隆位 点后。 便不能表达α片段，转化细菌后不能分解底物，结果使菌落呈现白色。α互补筛选又 称为蓝白筛选。 8、 简述  RT-PCR 原理及核酸类型。 答：首先， 经逆转录酶的作用从  RNA  合成  cDNA ，再以  cDNA  为模板， 扩增合成目的片段。 实验中所加入的特殊试剂 聚丙酰胺凝胶电泳： P47-48 、 53 1、 TEMED （三羟甲基氨基甲烷） ：加速剂，在碱性环境下处于自由碱基的状态并加速过硫酸铵的作用。 2、 AP （过硫酸铵）：产生自由基，使丙烯酰胺单体双链打开，形成自由基丙烯酰胺，引发聚合反应。 3、水层：在胶面封以水层可以避免直接与空气接触（ O2 能妨碍聚合），也可以使胶面变得 平整。 4、考马斯亮蓝：染色液 5、溴酚蓝：样品示踪染液 6、蔗糖溶液：保证样品的稳定性，不易悬浮在液体中。 7、 A 液： Acr-Bis 液：浓缩胶缓冲液 液：分离胶缓冲液 液：电极缓冲液 液： 1%过硫酸铵溶液 8、EB（溴化乙锭） ：核酸染色剂，可插入 DNA 双螺旋结构两个碱基之间，在紫外线的激发下发出橙光。 9、硫基乙醇：使二硫键还原。 DNA 琼脂糖凝胶电泳： P56~57 *1 、 TBE ： Tris-硼酸， EDTA （抑制细胞中的 DNase 活性） Western blot ：P61~63 1、封闭液：封闭膜上可能结合非相关蛋白的位点，降低非特异性结合的背景。本实验用的是牛血清白蛋白。 2、辣根过氧化物酶（ HRP）：标记羊抗人 IgG 抗体 3、 3,3’ -一二氨基联苯胺： HRP 底物 4、考马斯蓝：用于凝胶，检查蛋白质转移是否完全。 5、丽春红 S：用于 NC 膜上，可将蛋白质染红，短暂显色，判断是否有转移出蛋白质。 6、 TBS ：成分 NaCl,Tris,HCl ，用作缓冲液。 酶动力反应： P77、P84 1、磷酸苯二钠：被碱性磷酸酶水解成酚和磷酸盐。 2、 4-氨基安替比林：与酚在碱性溶液中作用形成红色的醌衍物。 3、铁氰化钾：催化酚和 4-氨基安替比林反应