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（五）、胰 将胰脏标本修剪切碎后消化，并使之浮于牛血清白蛋白溶 液之上，经过 3 次离心分离，收集细胞，在水浴槽中用旋转法 使细胞聚集，接种于涂布了胶原的培养皿，可获得体外培养 的胰腺细胞。 用品： （ 1 ）摇动式培养箱 （ 2 ）锥形瓶，容积 25ml ，经硅化处理 （ 3 ）尼龙筛，孔径 25μm 和 40μm ；透析袋、 5ml 或 10ml 吸管、 胶原涂布的培养皿 （ 4 ） HBSS 、无 Ca2+ 、 Mg2+ 、 HBSS (HBSS — DVC) （ 5 ） F12 组织培养液，加 20% 小牛血清 （ 6 ） I 型胶原酶： （ 7 ） 0.25% 胰蛋白酶，溶于柠檬酸盐缓冲液，每升含柠檬酸 三钠 3g ， NaCL 6g ，葡萄糖 5g ，用 NaOH 调 pH 至 7.6 （ 8 ）牛血清白蛋白（ BSA ） 结果： 其中 30~40% 可判断为腺细胞，在光学和相差显 微镜下都可观察到酶原小滴。 如果用已照射过的肺纤维细胞作为滋养层，细胞 的 3H — TdR 掺入及存活期均可明显增加。 （六）、肾 从基质中可以分离出肾小管细胞，因为这些细胞含 有 D — 氨基酸氧化酶，能够在 D — 缬氨酸中生长，基质 细胞则不可，用胶原酶消化切碎的肾脏组织 10h 左右， 再用吸管吹打则可获得肾小管及肾小球上皮细胞。 （七）、气管及支气管上皮 有血清存在。气管上皮细胞停止分裂，不会终分 化。在无血清培养液中接种气管组织碎块，可以促进 气管细胞生长，并抑制成纤维细胞生长。 二、中胚层细胞的培养 （一）、结缔组织细胞 在细胞培养中结缔组织细胞最容易生长，不需要特殊 条件。统称为成纤维细胞。成纤维细胞系中 3T3 系，成纤维 细胞可分泌 I 和 Ⅲ 型胶原，大量分泌 I 型胶原则是结缔组织细 胞的特点。结缔组织细胞可向多个方向分化。可采用组织 块法培养。 （二）、脂肪组织细胞 脂肪组织细胞中很难培养出脂肪细胞。成纤维细胞可 被诱导分化出脂肪细胞，血清中的脂肪形成因子可能具有 诱导作用。 （三）、肌肉组织细胞 骨骼肌、心肌、平滑肌细胞均可在体外培养中生长， 心肌细胞在培养中还具有自动节律性收缩功能，传代培养 后可能逐渐丧失这种功能。平滑肌细胞可通过胰蛋白酶或 胶原酶消化法从血管壁、气管壁及肠壁等获得 . （四）、软骨细胞 软骨分为生长部和休止部，休止部软骨细胞表现为终 末分化细胞的特性，无形成软骨基质的能力。生长部软骨 细胞在体外培养条件下代谢较活跃，具有形成软骨基质的 功能和成骨细胞的某些特性。 软骨细胞易于在弱碱性，增加 Mg2+ 浓度的培养液中生 长。由于软骨细胞包于糖蛋白基质中，必需消化方可获得 软骨细胞。用透明质酸酶、胰蛋白酶和胶原酶联合消化。 用品： （ 1 ） Geys 平衡盐溶液（ GBSS ）， pH7.0 ，为防止污染 可加入抗菌素，如 100U/ml 青霉素， 100μg/ml 制霉菌素 （ 2 ） F12 培养液加 12% 胎牛血清， 2.3m mol/L Mg2+ ， 100U/ml 链霉素， pH7.6 无血清 F12 培养液 （ 3 ） 0.5% 睾丸透明质酸酶，溶于 GBSS ，加入青霉素 100U/ml ，链霉素 100U/ml （ 4 ） 0.2% 胶原酶，溶于 GBSS （ 5 ） 0.2% 胰蛋白酶，溶于 GBSS （ 6 ） 0.25% 胰蛋白酶，溶于无 Ca2+ 、 Mg2+ 生理盐水 关节软骨细胞分离培养 ：将生后当天乳兔 12 只，分 3 次， 在无菌条件下解剖分离乳兔的双侧下颌骨髁状突，仔细剥离 髁状突软骨表面的纤维被膜，然后切取半透明状的髁状突软 骨，用锐利小剪刀将其剪碎成 1mm3 大小，放于离心管中， 先用 0.25% 胰蛋白酶 37 ℃ 消化 30min ，离心 5 min （ 1000rpm ），弃上清后加入 0.1% 胶原酶 IA 3ml ， 37 ℃ 下 消化 5h 后，用吸管将沉于底部的组织及细胞轻轻悬浮后， 用 200μm 滤网滤过后离心沉淀细胞，再用含 10?S DMEM 培养液（含青霉素 100IU/ml, 链霉素 100μg/ml ）将细胞悬浮 后，接种于培养瓶在 5%CO2 、 95% 空气、饱和湿度、 37 ℃ 孵浴箱内进行培养。 软骨细胞鉴定： 形态观察：多角形，类似上皮样细胞，可形成具有折 光性的细胞外基质，甲苯胺兰染色呈异染性。 细胞组织化学染色：软骨细胞