2020质粒DNA纯度的测定及其构型观察.pptVIP

实验二 质粒 DNA 纯度的测定及其构型观察 —— 琼脂糖凝胶电泳法 实验目的 ? 进一步区分质粒 DNA 中染色体 DNA 和 RNA 的 污染（ DNA 的纯度 ）； ? 观察质粒 DNA 三种 基本构象 ； ? 可用此法纯化 DNA 及计算出 DNA 的浓度 。 实验原理 ? 荧光物质 Goldview 在紫外光照射下能发出荧光 。 当 D N A 样 品 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 电 泳 时 ， 加 入 的 Goldview 就插入 DNA 分子中形成荧光络合物，使 发射的荧光增强几十倍 。 ? 荧光的强度正比于 DNA 含量 ，如将已知的标准样品 做电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。 ? 电泳后的琼脂糖凝胶直接在紫外灯下拍照，只需 5- 10ng 的 DNA ，就可从照片上比较鉴别 。 实验原理 ? 在一定电场强度下， DNA 分子的迁移取决 于分子筛效应，即 DNA 分子本身的 大小 和 构型 ( 相对分子质量不同的 DNA 片段泳动速 度不一样 ) 。因此， 凝胶电泳 不仅可分离 不 同相对分子质量 的 DNA ，也可以 分离相对 分子质量相同、构型不同的 DNA 分子； ? 在凝胶电泳中， DNA 分子的迁移速度与分 子量的对数值呈反比关系 。 ? 可以此特征区别染色体 DNA 、质粒 DNA 和 RNA 。 ? 若用小刀取下含质粒 DNA 的凝胶带经洗脱则可 得纯 DNA ，用单一切点的酶消化后，与已知分 子量大小的标准 DNA 片段进行电泳对照，观察 其迁移距离就可估计出该样品分子量的大小。 实验原理 ? DNA 分子在凝胶中泳动的速度还与 DNA 分子本身 的构型有关 ： ? 共价闭合环状 DNA （ cccDNA ） , 超螺旋结构泳动最快 ? 两条都断开的线状 DNA （ LDNA ），线性结构泳动速度 居中； ? 一条链断开的开环 DNA （ ocDNA ） , 复制中间体泳动最 慢。 因而可以通过电泳来区别质粒 DNA 的构型。 实验方法 ? 选择适当大小的 电泳槽 和 点样梳 ，点样梳底部离电 泳槽水平面的距离为 1-2mm 。 ? 制备琼脂糖凝胶 ：称取 1% 浓度的琼脂糖，加入 TAE 缓冲液，在微波炉上熔解，待凝胶冷却到50℃ 左右时，加入 Goldview 混匀后，轻轻倒入电泳槽 水平板上，除掉气泡。 ? 待凝胶冷却至凝固后， 取出点样梳 ，在电泳槽内 加 入电泳缓冲液 ，使其正好漫过凝胶表面。 ? 在待测样品中加入 6 × loading buffer ，混匀后小心 地进行点样。 每孔加样量视梳子的大小和胶的厚度 而定。 ? 打开电源开关， 最高电压不超过 5V/cm , 即小电泳槽 不得超过 50V ；当琼脂糖浓度低于 0.5% 时，电泳温 度不能太高。 ? 电泳时间随实验具体要求而定，一般待 DNA 带分开 后即可停止，当 溴酚蓝泳动至 2/3 凝胶时可停止电泳 ， 约需 1 小时左右。 ? 电泳结束后，小心取出凝胶， 将凝胶放在紫外观察 灯下观察电泳结果 。 质粒构型观察示意图 实验三 DNA 的纯度、浓度的测定 —— 紫外分光光度法 实验目的 从以上实验中提取到的质粒 DNA ，为了要作 下一步的 PCR 或者酶切试验，必须测定 DNA 的纯度和浓度。 实验原理 ? 核酸具有吸收紫外光线的能力，在波长为 260nm 的条 件下具吸收峰值，而蛋白质在 280nm 时具有吸收峰值。 ? 根据经验数据，纯核酸溶液 OD260=1.8 ～ 2.0 时，认 为已达到所要求的纯度。 ? 当 OD 260=1 时 dsDNA(dsRNA) = 50μg/ml ssDNA(ssRNA) = 40μg/ml 核苷酸 = 20μg/ml ? 当 RNA OD 260/ OD 280 ≈2.0 纯品 ? 当 DNA OD 260 /OD 280 ≈1.8 ～ 2.0 纯品 ＞ 2.0 RNA 污染 ＜ 1.8 pr 污染