实时荧光定量pcr技术的实验研究.pdfVIP

实时荧光定量 PCR 技术的实验研究 来源： 中国论文下载中心 [ 10-12-15 16:23:00 ] 作者：袁继红 摘要 实时荧光定量 PCR 技术是在普通 PCR 定性技术基础上 发展 起来的核酸定量技术 , 已广泛应用于不同研究领域。论述了荧光定量 PCR 技术的基本原理、主要类型和定量实验 方法 ,探讨了实验条件的控制、影响因素和优化实验结果的方法。 关键词 荧光定量 PCR 技术 ; 原理 ;主要类型 ;定量方法 ;优化 Abstract Real-time fluorescent quantitative PCR is a new kind of nucleic acid quantitative technique,which develops in the PCR qualitative technique base. It has been widely used in different research fields. In the paper,the experiment principles,the main types and quantitative methods of this technology were described. The control of experimental conditions,affecting factors and optimization of experimental results were discussed. Key words real-time fluorescent quantitative PCR;principle;main types;quantitative method;optimizing 实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出 ,该技术不仅实现 了 PCR 从定性到定量的飞跃 ,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自 动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点 [1] 。目前 ,该技术已广泛应用于分子生物 学、医学等学科和基础研究领域 ,特别是在 现代 农业转基因作物的定性检测、品系鉴定、转 基因成分含量的检测中发挥着重要作用 [2] 。 1 荧光定量 PCR 技术的原理 荧光定量 PCR 技术是在 PCR 反应体系中加入荧光基团 ,利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程 ,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 [3] 。由于常规 PCR 无法对扩增 反应进行实时检测 ,需借助凝胶电泳等手段对扩增终产物进行定性和半定量分析 ,不仅费时、 费事、易污染 ,且无法对起始模板准确定量。荧光定量 PCR 技术是在反应体系中加入荧光基 团,荧光基团发出的荧光信号随着反应进程而变化 ,每经过一个 PCR 循环反应 ,定量 PCR 仪收 集 1 个荧光强度信号 ,通过荧光强度变化检测产物量的变化 ,从而得到 1 条荧光扩增曲线 ,荧光 扩增曲线一般由基线、指数扩增期和平台期组成 [4] 。只有在荧光信号指数扩增阶段 ,PCR 产 物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系 ,才可以在这个阶段进行定量分 析。为了便于对所检测样本进行比较 ,在荧光定量 PCR 反应的指数期 ,需要设定 1 个荧光信 号的阈值 (threshold) 。荧光阈值是荧光扩增曲线上人为设定的一个值 ,荧光阈值的缺省设置是 3~15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍 ,用它可以定义样本的循环阈值