琼脂糖凝胶电泳法.ppt

琼脂糖凝胶电泳法 凝胶电泳是分离和纯化 DNA 片段最常用的技术。 根据制备凝胶的材料 : 琼脂糖电泳 凝胶 电泳 聚丙烯酰胺电泳 一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 的原理和方法 二、实验原理 琼脂糖 是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于 琼脂 糖的浓度 。 DNA 分子在碱性缓冲液中带负电荷 ，在外加电场 作用下向正极泳动。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有 电荷效应与 分子筛效应 。不同 DNA 的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA ，主要是利用分子筛效 应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因 而就可依据 DNA 分子的大小使其分离。该过程可以 通过把 分子量标准参照物 和样品一起进行电泳而 得到检测。 溴化乙锭（ EB ）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。 EB 可与 DNA 分子形成 EB-DNA 复合物，其 荧光强度与 DNA 的含量成正比。据此可粗略估计样 品 DNA 浓度。 注意事项： EB 是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样， 三、 实验材料、器具及药品 以前实验中提取的小麦总 DNA 和质粒样品。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波 炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖， 1XTAE 电泳缓冲液 ，溴化乙锭（ EB ）， 10X 载样缓冲液 四、实验步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入 100ml 1 × TAE 电泳缓冲液中，摇匀。 在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 ⑵ 用胶带将制胶板两端封好， 插入适当梳子 ，将 溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。 ⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳 槽中，加 1 × TAE 电泳缓冲液至液面覆盖凝胶 1- 2mm ，小心垂直向上拔出梳子。 ⑷ 用移液器吸取1μl的 10X 载样缓冲液于封口膜 上 , 再加入4μl 1× TAE 电泳缓冲液，最后加入 总 DNA 或质粒样品2μl，混匀后， 小心加入点 样孔 。 ⑸ 打开电源开关，调节电压至 3-5V/cm ，可见到 溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约 30min- 40min 。 ⑹ 将凝胶放入 EB 染液中染色 5-10min, 用清水稍微 漂洗。 ⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上 防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的 DNA 条带。 ? 植物总（核） DNA 样品应呈现一条迁移率很 小的整齐条带。 ? 质粒 DNA 应呈现二或三条不同构型的条带， 这时表明所提样品较纯。溴酚蓝前的荧光区 是样品中存有的 RNA 杂质。若质粒 DNA 样品在 迁移率小的地方还有荧光条带，表明质粒 DNA 样品中有细菌的染色体 DNA 污染。 琼脂糖电泳的优点 （ 1 ）琼脂糖含液体量大，可达 98-99% ，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。 （ 2 ）电泳速度快。 （ 3 ）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测 仪作定量测定。 （ 4 ）样品易回收，常用于制备。 ? 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA 分子大小来确定。 琼脂糖凝胶浓度与线性 DNA 分辨范围 常用的电泳缓冲液 4 ℃ 保存备用 . 常用的 10X 载样缓冲液 Ⅰ 0.25% 溴酚蓝 ， 0.25% 二甲苯青 ， 40% 蔗糖 水溶液 Ⅱ 0.25% 溴酚蓝 ， 0.25% 二甲苯青 ， 30% 甘油 水溶液