食管癌患者牙龈卟啉单胞菌优势菌株中fimA基因的克隆、表达及应用.pdfVIP

摘要 摘 要 目的 通过对牙周健康人群和食管癌患者的fimA 基因进行同源性分析，发 现食管癌患者中存在优势表达的菌株；利用基因工程和杂交瘤技术，制备FimA 蛋白单克隆抗体，为进一步研制P.gingivalis 快速诊断试剂盒提供物质基础。 方法 （1）fimA 基因在牙周健康人群和食管癌患者中差异的研究：收集74 例食管癌患者和 135 例牙周健康者口腔牙龈标本，PCR 扩增fimA 基因并测序， 将测序结果与fimA 基因6 个型别的标准菌株进行比对，计算fimA 基因在两组 人群中的检出率及不同基因型构成；利用Clustal X 软件对fimA 基因进行同源性 分析，观察在两组人群中的分布。 （2）食管癌患者优势菌株中fimA 基因的克隆 与表达：以食管癌患者优势菌株的fimA 基因为模板，构建原核表达质粒pET- 28a/fimA ，并转化至 BL21 大肠杆菌中，构建 BL21/pET-28a/fimA 工程菌，经 IPTG 诱导表达获得重组蛋白，利用His Trap HP 镍柱对其进行纯化。 （3）FimA 蛋白单克隆抗体的制备及应用：以上述基因工程FimA 蛋白免疫小鼠，获得杂交 瘤细胞株，制备单克隆抗体并鉴定其特性，制备ELISA 试剂与PCR 法进行比较 以确定其临床性能。 结果 1.fimA 基因在牙周健康人群和食管癌患者中差异的研究：经PCR 扩 增，fimA 基因在食管癌组和牙周健康组的阳性率分别为70.27%和41.48%，差 异有统计学意义 (P0.01)；fimA 基因分型结果显示，两组人群均以fimA Ⅱ型 占比最高，各型别之间构成无统计学意义(P 0.59)；经同源性分析，食管癌患者 fimA 基因在多个区域有明显的聚集簇，将其定义为食管癌患者的优势菌株。 2．食管癌患者优势菌株中fimA 基因的克隆与表达：成功构建原核表达质粒 （pET-28a/fimA）和原核表达菌株 （BL21/pET-28a/fimA-P008）。原核表达菌株 在含卡那霉素的培养基中，当A600 达 0.6 时，用 1mM 的IPTG 诱导，培养 12h 时，目标蛋白的表达含量最高；经检测，重组蛋白属于细菌包涵体蛋白，分 子量大小与预测结果一致，经 His Trip HP 镍柱层析，PAGE 电泳鉴定纯 度90%。3．FimA 蛋白单克隆抗体的制备及应用：成功制备了抗FimA-P008 蛋 6 白的杂交瘤细胞株和单克隆抗体。经检测，小鼠腹水抗体效价为 1：10 ；抗 FimA-P008 单抗亚型为IgG1型，此单抗特异性较好，与其他抗原无交叉反应； 利用制备的单抗通过ELISA 法检测P.gingivalis 的FimA 抗原，与PCR 法扩增标 本的fimA 基因相比较，两种方法结果差异无统计学意义 （P 0.20）。 结论 本实验成功找到食管癌患者P.gingivalis 的优势菌株，对其fimA 基因 I 摘要 进行克隆、表达并纯化FimA 蛋白，以此为免疫原，制备抗FimA-P008 单抗， 初步鉴定效果良好，为研制P.gingivalis 快速诊断试剂盒提供了物质基础。 关 键 词：牙龈卟啉单胞菌；食管癌；fimA 基因型；单克隆抗体 论文类型：应用基础研究 选题来源：食管癌早期预警及诊治新技术研发，161100311200，河南省重大科 技专项 II 目录 目 录 摘 要I ABSTRACTIII 目 录V 1 1 第 章 绪论 1.1 牙龈卟啉单胞菌介绍1 1.2 牙龈卟啉单胞菌菌毛的研究进展1 1.2.1 牙龈卟啉单胞菌菌毛的类别 1 1.2.2 牙龈