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ALG5 和SLC35A1 对猪流感病毒复制的影响 目录 摘要i Abstract iii 缩略语表 （Abbreviation ）vi 1 文献综述 1 1.1 流感病毒概述 1 1.1.1 猪流感 1 1.1.2 流感病毒的结构2 1.1.3 流感病毒的表达产物2 1.1.4 流感病毒的生命周期4 1.1.5 流感病毒与宿主因子 5 1.1.6 流感病毒与糖基化 6 1.1.7 流感病毒与唾液酸 7 1.1.8 猪流感的危害 8 1.2 宿主因子ALG5 9 1.3 宿主因子SLC35A1 9 1.4 CRISPR/Cas9 系统 10 1.4.1 CRISPR/Cas9 简介 10 1.4.2 CRISPR/Cas9 的应用 11 2 目的意义 13 3 材料和方法 14 3.1 实验材料 14 3.1.1 细胞与病毒 14 3.1.2 菌株、载体与质粒 14 3.1.3 引物与sgRNA 14 3.1.4 抗体和小分子化合物 14 3.1.5 主要酶、试剂及试剂盒 15 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位论文 3.1.6 主要培养基及其配制 15 3.1.7 相关试剂及配制 16 3.1.8 主要仪器设备 16 3.2 实验方法 17 3.2.1 细胞相关实验 17 细胞复苏 17 细胞冻存 17 细胞计数 17 细胞转染 18 细胞活力测定 18 3.2.2 病毒相关实验 18 流感病毒的增殖 18 流感病毒的细胞接种 18 流感病毒血凝价的测定 19 TCID50 的测定 19 病毒吸附实验与激光共聚焦 19 3.2.3 Western blot 蛋白表达检测实验 20 细胞总蛋白的提取及样品制备 20 SDS电泳 20 蛋白质转膜 20 Western blot 实验 21 3.2.4 单基因敲除细胞系构建 21 sgRNA 重组质粒构建 21 包装携带sgRNA 重组质粒的慢病毒 26 慢病毒感染及阳性细胞初筛 26 基因敲除效率检测 26 有限稀释法筛选单克隆细胞株 28 4 结果分析 29 4.1 利用CRISPR/Cas9 在候选基因中筛选SIV 复制重要宿主基因 29 II ALG5 和SLC35A1 对猪流感病毒复制的影响 4.1.1 构建sgRNA 重组质粒29 4.1.2 检测sgRNA 的基因敲除效率29 4.1.3 基因敲低对SIV 增殖的影响 30 4.2 ALG5 对流感病毒增殖的影响 31 4.2.1 PK-15-Cas9 细胞上筛选ALG5 敲除单克隆细胞株 31 4.2.2 ALG5 在PK-15-Cas9 细胞上敲除、过表达对SIV 增殖的影响 32 4.2.3 NPTr-Cas9 细胞上构建ALG5 基因敲除单克隆细胞系 33 4.2.4 ALG5 在NPTr-Cas9 细胞上敲除、过表达对SIV 增殖的影响 35 4.2.5 猪流感病毒感染对内源性ALG5 表达的影响 36 4.2.6 ALG5 敲除对其它流感毒株增殖的影响 36 4.3 SLC35A1 对流感病毒增殖的影响 37 4.3.1 构建SLC35A1 敲除细胞系及对SIV 增殖的影响 37 4.3.2 SLC35A1 敲除抑制猪流感病毒吸附 39 4.3.3 SLC