尿液中囊泡的提取和鉴定概要.docxVIP

尿液中 exosome 的提取和鉴定 一、 exosome的提取 （一） 实验准备 试剂： Sigma P2714 ，三乙醇胺， NaOH ，蔗糖，去离子水耗材：超速离心管 50mL ， 15mL 配制 Isolation solution 50 mL 1. 10 mM Triethanolamine （三乙醇胺）（ MW 185.7 ） 0.093 g 2. 250 mM Sucrose （蔗糖）（ MW 342.3 ） 4.28 g 3. 加去离子水 至 45 mL 4. 1 M NaOH 调 pH 至 7.6 ~220 μ L 5. 加去离子水 至 50mL 6. 加 protease inhibitors day of isolation 3. 3. 5× SDS-Laemmli for Western Blot 50 mL 1. SDS 3.75g 2. Glycerol 15 mL 3. 1 M Tris-HCl ， pH 6.8 2.5 mL 4. Bromophenol 溴酚蓝 dab 5. DTT 60 mg/mL 6. 去离子水至 50 mL （二） 实验步骤 (Pisitkun 2004; Gonzales, Zhou et al. 2010) 1. 将－ 80℃冻存的尿液取出解冻，涡旋，分装在 50mL离心管中。 2. 从 -20 ℃中取出 Sigma P2714 蛋白酶抑制剂，加入 5mL二次水混匀。 3. 每 50mL尿液中加入 625 μL 溶解后的蛋白酶抑制剂（ 12.5 μ L/mL Urine ）。 4. 于 4℃， 17000 × g 离心 15 min 。（新鲜尿液 25℃离心） （超速离心机型号 Hitachi CP 80MX） 5. 取上清液置于超速离心管中，装 3 管，每管分装 8mL， 4 ℃ 200 000 × g 离心 1 h 。（同 上新鲜尿液 25℃） 离心后弃上清，再取 17000 × g 上清各 8mL分置 3 管中，同上述条件离心。 弃上清， 3 管中各加 50μ L isolation solution ，涡旋混匀 30 s，转移到一个 1.5 mL Eppendrof 离心管中。 8.加 1 mL 200 mg/mL DTT 95 ℃孵育 2 min 9. 将上述溶液转移至高速离心管中，并加入 离心 10min。 10. 弃上清，加 50 μ L isolation solution  。  8 mL isolation solution 17000 溶解沉淀物，在 17 000 ×  g  × 离心  g 超高速 15 min 。 取上清做 1D SDS/PAGE. Bradford 法测蛋白总浓度。 按 1:4 体积比加入 5× SDS-Laemmli 缓冲液（含 60 mg/mL DTT ），涡旋混匀。 13.60 ℃加热 10 min ， -80 ℃保存。（ for western blot ） 朱墨桃师姐提取 exosome 方法 (Zhu, Li et al. 2012) 1. 2,000 g for 10 min at 4 °C ，除去死细胞； 2. 取上清， 4 °C 10,000 g 离心 30 min ，除去细胞碎片； 3. 取上清， 4 °C 110,000 g 离心 70 min ，弃上清； 4.PBS 清洗并重新分散， - 80 °C保存。 5.microbicinchoninic acid assay (Applygen Technologies Inc, China) 测定蛋白含量。 二、 负染电镜分析 （一）实验准备 4%paraformaldehyde 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4 ），1 %Uranyl acetate 乙酸双氧铀 in dd-H2O，石蜡膜， 200 目镍网 （二）实验步骤 1. 将 20μ L exosomes 小体悬样与 4% 多聚甲醛（ in PBS ， pH 7.4 ）1： 1 混匀。 2. 取 10μ L 混合物滴于石蜡膜上，将 200 目镍网置于液滴中悬浮 10min。 用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。 在 20μ L PBS 液滴中悬浮 5min，重复。 在 20μ L 去离子水液滴中悬浮 5min，重复。 1% 乙酸双氧铀负染液负染 1 min ，用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。 7. 将镍网正面朝上置于滤纸上，在有盖的玻璃皿中干燥 15min 。 样品准备完毕，进行 EM分析。 三、 1D SDS （一）实验准备 储存液配制： 1） 2 M Tris-HCl 2） 100 g/L SDS 溶液 3） 7